Guikema研究所の研究は、オランダ科学研究機関（VIDIグラント016126355）およびStichting Kinderen Kankervrij KiKA（プロジェクト252）のInnovational Research Incentives Schemeによる資金提供を受けています。

1.細胞の処理とDNA損傷誘導<ol><li> 20％FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したIMDM中のヒトBCR-ABL + B細胞急性リンパ芽球性細胞系BV173またはSUP-B15を、 37℃、5％CO 2の雰囲気下で培養した。細胞を計数し、5mL /ウェルで6ウェルプレート中で2×10 6細胞/ mLでプレートする。 注：任意に、様々な起源の懸濁細胞株を使用することができる。 </li><li> 細胞周期のG1期のBCR-ABL + B-ALL細胞を停止させるために、5μMのイマチニブメタンスルホネート（STI571）を添加し、一晩インキュベートする。 <ol><li>必要に応じて、細胞周期またはBCR-ABL陰性細胞タイプ全体でタンパク質 - タンパク質相互作用を研究する場合は、このステップを省略してください。 </li></ol></li><li> 50 ng / mLのネオカルジノスタチン（NCS）を培養液に添加してDNA損傷を誘導し、2時間インキュベートする。 <ol><li>あるいは、放射能源[ 137 Cs]を0.5Gy /分で5Gyの線量で照射することによりDNA損傷を誘発する。照射後、37℃、5％CO 2雰囲気下で細胞を2時間回復させる。 </li></ol></li><li>場合によっては、DNA損傷に応答するATMキナーゼ活性の関与を評価するために、ATMキナーゼ阻害剤KU55933をNCSの添加または照射処理の前に5μM添加する。 </li><li>ビーカーまたは三角フラスコ中の50mLの1×PBSの上に5gの画分V BSAを重層し、BSAが溶解するまで室温で放置することにより、1×PBS + 10％BSAを調製する。激しい発泡を引き起こすので、振り混ぜないでください。ゆっくりと0.22μmフィルターでろ過し、氷上に置く。 </li><li>細胞を採取し、氷冷1×PBSで2回洗浄する。細胞を数え、1×PBS + 10％BSA中で2×10 6 / mLで再懸濁する。細胞を氷上に置く。 </li></ol> 2.細胞遠心、固定および浸透<ol><li>準備する新たに1×PBS中4％パラホルムアルデヒド溶液。 2mLのPFAを50mLの1×PBSに添加し、溶液が透明になるまで55℃の振盪水浴中でインキュベートする。溶液を0.22μmフィルターで濾過し、使用するまで室温で保存する。 注：必要に応じて、4％PFA固定液を-20℃で凍結保存することができます。凍結後、使用のために一度だけ解凍する。そうでなければ、PBS中の4％PFA溶液を直接購入することができる。 </li><li>糸くずのない組織で76 mm x 26 mmの顕微鏡スライドを注意深く磨き、Coplinジャーで96％エタノールに5分間入れて脱脂する。顕微鏡を10分間空気乾燥させる。 </li><li>顕微鏡スライドを6mmの領域でサイトスピン/細胞学の漏斗に組み込む。 50μLの1×PBS + 10％BSAを各漏斗に分注し、500 rpmで1分間遠心分離することによりスライドをプレコートする。 </li><li> 100μLの細胞懸濁液（0.2×10 6細胞に等しい）を各漏斗に加え、500rpmで5分間遠心分離する。各抗体の組み合わせについて、ast 4の調製が必要である（二重抗体実験;二つの単一抗体対照;抗体対照なし）。 </li><li> 慎重に漏斗を分解し、その斑点に触れないようにしてください。すぐに固定のサンプルに進みます。 <ol><li>任意に、スライドを少なくとも30分間空気乾燥させる。風乾した後、スライドをアルミ箔で個別に包み、使用するまで-20℃で保存します。凍結した調製物を使用する場合は、スライド上に結露が発生しないように、ペーパータオルに包まれたスライドを解凍してください。 </li></ol></li><li> PAPペンの液体ブロッカー（先端5 mm）を使用して、スポットの周りに円（およその直径15-20 mm）を描きます。 </li><li>各スポットに50μLの4％PFA固定溶液を加え、RTで30分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1×PBSで5分間3回細胞を洗浄する。 </li><li>糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させ、できるだけ多くの液体をスポットから除去するペットにスポットに触れることなく、またはスライドを傾けて各スポットに50μLの0.25％Triton-Xを1×PBSに加え、攪拌せずに室温で10分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー中のTBS（TBS-T）中の〜50-60mLの0.05％Tween-20中で5分間スライドを3回洗浄する。 10枚のスライドをこのようにして同時に処理することができる。 </li></ol> 3.ブロッキングおよび一次抗体インキュベーション<ol><li> TBS-Tをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。ブロッキング溶液を短時間ボルテックスし、各スポットに1滴（約40μL）を加えます。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>使用する前に、市販の抗体希釈液、ボルテックス抗体希釈液中で、1：1,000のヤギ抗ATMと1：100のウサギ抗ホスホSer15-p53を混合することにより抗体カクテルを調製する。対照実験のためにヤギ抗ATMおよびウサギ抗ホスホSer15-p53抗体（単一抗体対照）のみを含有する抗体希釈液を調製する。 </li><li>ブロッキング溶液を除去するが、抗体希釈液を添加する前に細胞を乾燥させないように注意する。各抗体カクテル希釈液30μLを加え、4℃で一晩加湿チャンバー内でインキュベートする。 </li><li> バッファーAとバッファーBミックスの1つの袋の内容物をそれぞれ最終容量1,000mLの水に溶解して、その場で洗浄バッファーAと洗浄バッファーBを調製する。 <ol><li>あるいは、8.8gのNaCl、1.2gのトリス塩基および0.5mLのTween-20を800mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Aを調製する。 HClを用いてpHを7.4に調整し、最終容量を1,000mLにする。 </li><li>あるいは、5.84gのNaCl、4.24gのトリス塩基および26.0gのトリス-HClを500mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Bを調製する。 HClを用いてpHを7.5に調整する。水を最終容量1000 mLになるまで加えます。 </li><li>フィルタ両方の溶液を0.22μmのフィルターに通した。 </li></ol></li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1x in situ洗浄バッファーAで5分間スライドを2回洗浄する。 </li></ol> PLAプローブ、ライゲーションおよび増幅<ol><li>抗ヤギプラスおよび抗ウサギMINUSを市販の抗体希釈液で1：5の両方で希釈することによってPLAプローブを調製する。スライドから1x in situ洗浄バッファーAをタップし、各スポットに30μLのPLAプローブ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。 注：適用された一次抗体が異なる種で育成され、PLAプローブの組み合わせが常に存在すべきである限り、二次抗体PLUSおよびMINUS PLAプローブの任意の組み合わせ（抗マウス、抗ウサギ、抗ヤギ）を使用することができるPLUSプローブとMINUSプローブが含まれています。 </li><li>穏やかに撹拌しながら室温でCoplinジャー中で〜50-60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する&lt;/ li&gt; <li> 1μLのリガーゼを39μLのライゲーション溶液に添加し、40μLのライゲーション - リガーゼ溶液を各スポットに加えることによって、氷上でライゲーション - リガーゼ溶液を調製する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で30分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー内の約50〜60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する。 </li><li>増幅ストック溶液を水で1：5に希釈することにより、氷上で増幅 - ポリメラーゼ混合物を調製する。次に、0.5μLのポリメラーゼを各スポットの1×増幅溶液39.5μLに加える。 注：増幅試薬は感光性であり、光に直接暴露されないように保護する必要があります。増幅試薬は、4つの異なる色（RED：励起594nm、発光624nm、励起644nm、発光669nm、ORANGE：励起554nm、発光576nm、緑色：励起501nm、発光523nm）利用可能な顕微鏡検査の設定がuitable励起特性とこれらの色をイメージングするフィルタ。 </li><li> 1x in situ洗浄バッファーAをタップし、スポットあたり40μLの増幅 - ポリメラーゼ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で100分間インキュベートする。 </li></ol> 5.取り付けとイメージング<ol><li> 99mLの水に1mLの1mLのWash Buffer Bを加えて、0.01x in situ洗浄バッファーBを調製します。 </li><li> Amplification-Polymerase混合液をタップし、Coplinジャーで緩やかに攪拌しながら室温で1x in situ洗浄バッファーBで10分間2回スライドを洗浄する。 </li><li>スライドを0.01x洗浄バッファーBで1分間洗浄する。 </li><li>余分な0.01x洗浄バッファーBをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。 </li><li> DAPIを含まないマウンティング培地をDAPIを含まないマウンティング培地で1：5希釈して、核の過剰な染色を避ける。 </li><li> 25〜30μLの1：5DAPI含有マウント媒体を24mm×24mmのカバースリップに加え、スライドでカバースリップを拾い、気泡が閉じ込められていないことを確認します。ネイルポリッシュでカバースリップをシールし、イメージングの前に少なくとも15分間待つ。 </li><li> （共焦点）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。 <ol><li>少なくとも4つの獲得された画像フィールド（20×対物レンズ、条件または抗体の組み合わせにつき少なくとも20個の細胞を計数し、処置された細胞において7±5個のシグナルの予想平均を用いた出力計算に基づいて細胞あたりの点陰性PLAシグナルの数を数え、以前に報告されたように、タイプIエラーが0.05の確率、および80％の出力の確率で、未処理の細胞では2±2シグナルであった。 注：最高の解像度は、ソフトウェアパッケージ（ImageJ、Leica Acquisition Suite（LAS）など）を使用してZスタックとデコンボリューションを取得することによって実現されます。サインDAPI染色によって定義されるように、核周囲内で容易に識別可能であるべきである。 </li><li>核の外側にはっきりと現れるシグナルは数えないでください。典型的には、NCS処理またはγ照射は、1細胞あたり約5〜10のphosho-p53 / ATM PLAシグナルを生じる。 「単一抗体」コントロールはバックグラウンドシグナルを与えるかもしれないが、これは20個の細胞のうち1個あたり1〜2個のPLAシグナルを超えてはならない。 </li><li>出版およびプレゼンテーションの目的で、40倍または63倍の浸漬油の対物レンズを使用して画像を取り込みます。スライドは4℃で保存することができ、光の当たらないように保護する必要があります。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways.">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li><li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53.">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy.">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

この報告では、PLAを用いて、懸濁細胞培養におけるタンパク質間の特異的相互作用を決定し可視化することができることが示されている。注目すべきは、ここに記載されたプロトコールは、DNA修復複合体の研究に限定されず、懸濁細胞培養における他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化および定量化するためにも適用される。 ATMキナーゼは、DNA損傷誘発剤に暴露された場合、G1-停止...

DNA損傷は、タンパク質 - タンパク質相互作用、およびDNAの効率的かつ迅速な修復を確実にする翻訳後修飾を含む高度に制御された一連の事象を誘発し、それによってゲノムの完全性1を保護する 。典型的には、DNA修復は、（共焦点）蛍光顕微鏡法によるいわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をモニターすることによって電離放射線に曝露された細胞において研究される。多くのDNA修復およびDNA損傷感知タンパク質はIRIFを形成し、これはDNA損傷を維持するクロマチン部位で核形成するタンパク質複合体を表す2,3 。時間の経過とともにIRIFの位置と解像度は、DNA修復の時空間的組織化に重要な洞察を与え、異なるDNA修復経路の関与を示している可能性がある。損傷が達成されたDNA損傷および細胞周期段階の性質は、どのDNA修復経路が活性化されるかを決定する。フォ<html> DNA複製（S期）に活発に関与する細胞では、相同組換え（HR）が優性のDNA修復経路であるのに対し、細胞周期のG1期またはG2 / M期の細胞では、相同末端結合（NHEJ）修復経路が優勢である。 DNA損傷後の最も初期の事象の1つは、細胞周期のG1-およびG2 / M-相において大部分が活性であり、NHEJを調節するDNA損傷感知キナーゼAtaxia毛細血管拡張突然変異タンパク質（ATM）の活性化であり、 HRを活性化することによってS期に作用するRad3関連タンパク質（ATR）を含むが、これらに限定されない。 ATMとATRの両方は、DNA修復、細胞死および生存に関与する多くのタンパク質をリン酸化する非常に多面的なキナーゼである4 。両方のキナーゼは、遺伝毒性ストレスに曝された後に腫瘍抑制タンパク質p53をリン酸化して活性化することが示されており、これらのキナーゼは、重要な腫瘍抑制シグナル伝達軸の上流メディエーターであることが示されている&quot;xref&quot;&gt; 5,6。 IRIFの形成および組成は、典型的には、2色免疫蛍光染色および顕微鏡法を用いて異なるタンパク質の共局在を決定することによって評価されるが、修復タンパク質複合体の一部であるタンパク質のすべてがIRIFを形成するわけではない。さらに、（共焦点）免疫蛍光顕微鏡法は、光の回折特性によって制限され、約200〜300nmの空間分解能がかなり低く、ほとんどの細胞内構造のサイズを超えており、本質的にタンパク質 - タンパク質相互作用分子レベル。このように、（共焦点）蛍光顕微鏡によって検出される免疫蛍光染色パターンの共局在化は、必ずしも直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用を示すものではない。最近、3次元構造物のような新しい超解像技術が開発されている共焦点レーザー走査顕微鏡8で検出できなかったこれらのタンパク質の空間分布特性を明らかにする、ナノスケールの詳細における53BP1およびBRCA1 IRIF形成の研究に首尾よく使用された、テューティング照明顕微鏡（3D-SIM） 7 。 イン・ビボでのタンパク質 - タンパク質相互作用、例えば共免疫沈降法、プルダウン法および酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を検出するために、いくつかの他の方法を使用することができる。しかしながら、これらの技術はかなり煩雑であり、多量の細胞またはタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の過剰発現を伴い、実験的人工物を導入する。最近では、Proximity Ligation Assay（PLA） 9,10と呼ばれるin-situ （ すなわち 、細胞および組織における）タンパク質 - タンパク質相互作用の視覚化および定量化を可能にする新規な技術が開発されている。 Pr関心対象の2つのタンパク質を認識する二価抗体は、オリゴヌクレオチド（いわゆるPLAプローブ）にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。 2つの異なる二次抗体が、一次抗体によって認識されるタンパク質間の相互作用のために十分に接近している場合、結合オリゴヌクレオチドはハイブリダイズし、ライゲーションして閉環状DNA基質を形成することができる。この環状基質は続いてローリングサークル増幅により増幅され、蛍光色素と結合した相補的オリゴヌクレオチドで視覚化される。 PLAを使用すると、蛍光標識されたローリングサークル増幅産物がPLAプローブに付着したままであるので、タンパク質 - タンパク質相互作用の細胞内局在が保存される。このアッセイの分解能は、抗体の直径が約7〜10nmであるという知見に基づいて&lt;50nmである11 。ローリングサークル増幅は、2対の抗体（プライマリ+セコンdary）は、そのサイズ（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）で定義される周囲内で物理的に相互作用します。シグナル増幅工程は、PLAアッセイの感度を高め、ほとんど発現しないタンパク質の相互作用の検出を可能にする。 PLAは、細胞間単位で定量することができる点状の病巣様シグナルパターンを生成し、それによってタンパク質 - タンパク質相互作用における細胞内および細胞間の変動を評価することができる。 DNA修復複合体およびIRIFの形成および組成は、ヒト骨肉腫上皮細胞株U2OS、ヒト胎児腎細胞株HEK293および網膜色素上皮細胞株RPE-1のような接着細胞株で研究されており、増殖し、トランスフェクションしやすい。これらのリンパ系細胞系および骨髄系細胞系のような懸濁細胞培養は、トランスフェクションの影響を受けにくく、一般的にカバーガラスに付着しないため、使用頻度が低いイメージングのためのeps。しかし、DNA損傷応答は、これらの腫瘍におけるゲノム（ドライバー）異常によって頻繁に影響され、正常なリンパ系および骨髄系の悪性形質転換において中心的な役割を果たすため、リンパ系および骨髄系の悪性疾患の状況において、前駆細胞）細胞12,13,14 。 このプロトコールは、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導後にPLAがどのようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用を評価および定量するために使用され得るかを記載する。ここで、PLAは、G1期の細胞周期停止を受けるように誘導されたヒトB細胞白血病細胞におけるDNA損傷に対するATMとp53との間の相互作用を決定し可視化するために行われる。注目すべきは、ここに提示されたプロトコルは、G1拘束性白血病細胞におけるATMおよびp53相互作用の研究に限定されないが、他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化するために使用することもできる種々の細胞型および懸濁細胞培養における細胞の増殖を阻害する。

<table><tbody><tr><td>BV173 cell line</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>SUP-B15 cell line</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib methanesulfonate</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td></tr><tr><td>neocarzinostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td></tr><tr><td>Starfrost Microscopy Slides</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen liquid blocker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin funnel</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Also available from various other vendors</td></tr></tbody></table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA損傷応答は、自発的に起こる、遺伝毒性ストレスに起因する、またはリンパ球におけるプログラムされたDNA切断の状況で現れるDNA損傷の修復を調整する。 Ataxia-Telangiectasia突然変異キナーゼ（ATM）、ATMおよびRad3関連キナーゼ（ATR）およびDNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PKcs）の触媒サブユニットは、DNA損傷の誘導時に活性化される最初のものであり、 DNA修復、アポトーシスおよび細胞生存を制御するネットワークの中央調節因子である。腫瘍抑制経路の一部として、ATMおよびATRはリン酸化を介してp53を活性化し、それによってp53の転写活性を調節する。 DNA損傷はまた、DNA損傷センサの複合体を表す、いわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をもたらし、蛍光顕微鏡検査によって視覚化されるDNA損傷部位に蓄積する。しかし、IRIFにおけるタンパク質の共局在は、必ずしもd蛍光顕微鏡法の分解能が限られているため、直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用が必要である。 その場での近接性ライゲーションアッセイ（PLA）は、前例のない特異性および感度を有する細胞および組織におけるタンパク質 - タンパク質相互作用の直接的な可視化を可能にする新規技術である。この技術は、目的のタンパク質に結合する特異的抗体の空間的近接性に基づいている。調べられたタンパク質が約40nm以内にある場合、増幅反応は、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドによって誘発され、増幅産物は、蛍光標識によって視覚化され、相互作用タンパク質の細胞下の位置に対応するシグナルを生じる。 ATMとp53との間の確立された機能的相互作用を例として、ここでは、DNA損傷応答の不可欠な部分であるタンパク質間の直接的相互作用を研究するために、浮遊細胞培養においてPLAがどのように使用され得るかが実証される。

残基Ser15におけるp53のリン酸化は、ATMキナーゼ活性に依存することが示された16 。懸濁細胞培養のサイトスピン調製物に対するPLA技術の特異性を実証し確認するために、細胞周期のG1期に停止したBCR-ABL + B-ALL細胞の2時間のNCS処理によるDNA損傷の誘導が示されている予想通り、ATMとホスホ-Ser15-p53との間の特異的相互作用を生じた。 NCSで処理した細胞の...

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

detection-visualization-dna-damage-induced-protein-complexes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.9K ビュー.  Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE). ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。 

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

生物工学

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

遺伝学

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

生化学

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

の検出<em&gt;その場で</emで&gt;タンパク質 - タンパク質複合体<em&gt;ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用&gt;幼虫神経筋接合部

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

神経科学

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

がん遺伝子由来の転写-複製コンフリクトを研究するための近接ライゲーションアッセイ

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

がん研究

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

生物学

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA損傷におけるタンパク質相互作用と局在の評価

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:近接リガンドアッセイとGamma-H2AX染色を組み合わせて、DNA損傷応答におけるタンパク質相互作用を特徴付ける(英語)

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

要約

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DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソフォームの Heterodimerization の検出

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

の検出

がん遺伝子由来の転写-複製コンフリクトを研究するための近接ライゲーションアッセイ

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

要約

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DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

の検出

がん遺伝子由来の転写-複製コンフリクトを研究するための近接ライゲーションアッセイ

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソフォームの Heterodimerization の検出