Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC分化神経前駆細胞へ<ol><li>大（ただし、サブコンフルエント）のコロニーが胚様体（EB）中間体を介して神経分化のための準備ができるまで、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層上で共培養（HES）メディア（ 表1）ヒト胚性幹細胞でhiPSCsを成長と拡大（ 図2）。ルーチンhiPSC培養条件は、他の場所16,17に記載されている。簡単に言うと、コラゲナーゼ（DMEM中に1mg / ml）で酵素的に通過その後、コンフルエントになるまでMEFフィーダー層上HES培地でhiPSCsを成長させ、約1拡大：7日ごとに3。 </li><li>ポリ-L-オルニチン/ラミニンを調製するためにプラスチック表面（ガラス面50グラム/ ml）のための滅菌水を10g / mlのポリ-L-オルニチンを有するプレート、被覆プレートをコーティングし、3-24時間、室温でインキュベートする。滅菌水で少なくとも一度洗った後、3-24時間、室温で滅菌PBSで5グラム/ mlのラミニンでコート。 注：プラスチックに包まれている場合、プレートが可能6ヶ月まで-20ºCのために保存。 </li><li> 1日目に、酵素的にDMEM / F12中に1mg / mlコラゲナーゼIVを使用して、プレートのような大きなコロニーから（例えば、マトリゲル上のTeSR 18として定義された培地中で成長、一般MEF上で成長し、またはhiPSCs）サブコンhiPSCsを持ち上げる。 注：37ºCでのインキュベーションの1-2時間後、コロニーが皿にフローティングされます。 </li><li>穏やかに2ミリリットル/ウェルのN2 / B27培地（ 表1）および非接着性6ウェルディッシュに移し（中に再懸濁1に3ウェルを組み合わせ、DMEM / F12に（遠心分離ではなく、沈降によって）1-2xをhiPSCコロニーを洗う型ウェル）19。 注：一晩、コロニーは「胚様体」（EBS）と呼ばれるフローティング球状のクラスターを形成することになる。かなりの細胞死を期待。 </li><li> 2日目に、プレートを傾けてEBを沈降させる。慎重にメディアを削除し、破片を除去するDMEM / F12で一回洗浄します。デュアルSMAD阻害剤（0.1M LDN193189と10M SB431542）12を補足したN2 / B27メディアにフィード</SUP&gt;。 </li><li>日3-7日、神経誘導は、デュアルSMAD阻害のコンテキストで発生します。 EBをラウンドしかし、嚢胞性ではないことを確認してください。 EBを0.1M LDN193189と10M SB431542を補足したN2 / B27メディアと一日おきにフィード。 </li><li>日7月14日、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたプレートにEBのメッ​​キに続いて、上の神経ロゼットは（apico-基底極性の神経上皮細胞のラウンドクラ​​スタとして特徴づけ、数日以内に出現し始めることを明視野顕微鏡を用いて確認してください。 図1）。 0.1M LDN193189、10M SB431542および1グラム/ mlのラミニンを補足したN2 / B27培地で一日おきに付着したEBを供給し続けます。 </li></ol>神経ロゼットの2収穫注：我々は、神経ロゼットが酵素的に神経ロゼットセレクション試薬20または類似の選択試薬を用いて回収することをお勧めします。神経ロゼットは、Th1、6ウェルポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングされたプレートに手動でピックアップすることができますがの方法は、さらに、NPCのために豊かにし、非神経細胞型を枯渇させるために、20日目でのピッキングの第二ラウンドを必要とすることが、ユーザのスキルに依存して、マスタに広範囲の訓練をとり、。 <ol><li> 14日目の神経ロゼットの酵素的選択のために、付着したEBから吸引メディアと6ウェルプレート用のウェルあたりの神経ロゼット選択試薬の1ミリリットルを追加します。 1時間37ºCでインキュベートする。 </li><li> P1000のピペットマンを使用すると、静かに各ウェルから酵素を除去。洗浄するためにウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルを追加します。 </li><li> P1000では、DMEM / F12の1ミリリットルを収集し、すぐにこのようにプレートからロゼットを取り外し、バックウェルにDMEM / F12を追放。ファルコンチューブにロゼットを収集します。 </li><li>ピペットDMEM / F12とすぐに別の1ミリリットルが残りロゼットを切り離すために、同じウェルに放出する。 （粉末化しないでください。ロゼット凝集体を分割しないようにしてください）​​。同じファルコンチューブに神経ロゼットを収集します。 </li><li>手順を繰り返し、必要に応じて2.4。ロゼットは、容易に切り離すていない場合は、MOを追加酵素を再し、プロセスを繰り返す（2.1〜2.4ステップ） </li><li> 3分間300×gで細胞をスピン。吸引しNPC培地（ 表1）2ml中の洗浄、および再懸濁ロゼット。転送細胞（1：1）、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングした6ウェルプレートに。 </li><li>日15-21からは、神経ロゼットが展開されます。 NPCメディアに一日おきにロゼットを養う。 </li><li>神経ロゼットの品質を評価し、平らな線維芽細胞様細胞が培養中で拡大されていないことを確認してください。 注：非ロゼットが解決しない場合は、NPCの文化は時々のAccutaseに拾っロゼットの唯一の最高の選択、手動ピッキングによって救済することができます。 37ºCで15分間解離する。ペレットを、24ウェルのポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆プレート上にNPC培地で洗浄し、プレート。 </li></ol>神経前駆細胞の3.拡張注：hiPSC NPCはマトリゲルまたはポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングしたプレートのいずれかで成長させることができる。当社は通常Matrigeを使用リットルプレートそれらはより迅速かつ低コストで製造することができる。 <ol><li>すぐに、マトリゲルでコーティングされたプレートを準備解凍し、24ミリリットルでマトリ1mgの凍結した一定分量を再懸濁冷たいDMEM / F12を、すぐに2つの6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを配布する。 37ºCで少なくとも1時間インキュベートする。 NOTE：マトリゲルを洗浄しないだけ吸引する必要がある、使用直前に。 </li><li>一日おきのNPCを養う非常に高い密度で維持するか、またはそれらが自然発生的にニューロンに分化する。 より確立されたNPCは、通常、1分割されているが：：注としてまれに1回と隔週2：毎週4を、非常に低い通路NPCは1を分割することができる。 </li><li> 、スプリット最初の吸引メディアと6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットル暖かいのAccutase（1X）を追加する。 10〜15分間37ºCでインキュベートする。 </li><li>静かにできるだけ機械的ストレスを含むDMEM / F12を含む15ミリリットルチューブに剥離した細胞を移す。酵素にいる間の細胞を滴定しないでください。 spinniによるペレット細胞5分間千×gでngの。 </li><li>吸引し、6ウェルのオリジナルのウェルあたり〜1ミリリットルNPC培地中での洗浄、および再懸濁のNPC。 注：6ウェルディッシュのコンフルエントよく5-10万個の細胞を有することを期待する。これは、従来の再メッキ血球計数器を用いて細胞10μlのアリコートを計数することによって確認することができる。 </li><li> NPCは、ニューロンまたはニューロスフェアとして再懸濁、再プレートのNPCに続いて。 NPCは、6ウェルプレートのウェル当たりプレート約100万〜200万細胞を維持するために。ニューロスフェア形成の効率は、実験および細胞株の間で変動するが、200,000から1,000,000細胞を非接着性6ウェルプレートのウェルに播種された場合、一般的に最高の​​発生ができる。ニューロスフェアの凝集が発生した場合、播種した細胞の数を減少させる。ニューロン培地でNPC培地を交換し、6ウェルプレートのウェルあたりのニューロンに分化する、プレート約200,000細胞。 </li><li>免疫組織化学的にすべての確立されたNPCラインを検証する。十分な細胞物質はEXPANれていたらネスチンおよびSOX2のための抗体とDED、ラベルのNPC。検証済みNPCラインも4〜6週間ニューロンに分化し、およびIIIチューブリンとMAP2ABための抗体で標識されるべきである。 <ol><li> 10分間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 PBS中1.0％トリトンで室温で15分間のNPCを透過性にし、次いで室温で30分間0.1％トリトン5％ロバ血清でブロックする。 </li><li> 4℃で一晩、0.1％トリトン5％ロバ血清中で一次抗体と共にインキュベートする。 注：私たちは、以下の抗体を推奨：ヤギ抗Sox2の、1：200。マウス抗ヒトネスチン、1：200。ウサギ抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗MAP2AB、1：200。 （ 図2）。 </li><li> RTで1〜2時間、0.1％トリトンで5％ロバ血清中で、300：PBSで洗浄した後、1でヤギ、マウスまたはウサギへの適切な結合二次抗体と二次抗体の細胞を培養する。を0.5μg/ mlのDAPI（4 &#39;、核染色細胞を可視化、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）、次いで、封入剤でマウントする。 </li></ol></li></ol> 4. NPC伝達<ol><li>トランスフェクトされた細胞21の割合を増加させるためにspinfection（1時間、1,000×gでのウイルスの存在下での細胞培養プレートの遠心分離）を使用する。 NPC培地で希釈感染の所望の多重度（MOI）の力価を測定培地を吸引し、関連する過剰発現（または制御）と交換してレンチウイルス（またはレトロウイルス）、（通常は1-10）、。 1.5ミリリットルを6ウェルプレートのウェル当たりの体積（または組織培養プレートの他のタイプの適切にスケーリングされたボリューム）を使用する。千×gでスピンとプレート遠心機で1時間37ºC。 注：理想的には、分割の1〜2日以内に、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターでのNPCを伝達する。商用または実験室で準備されたウイルスを使用しているかどうか、それが適切に連続希釈によって事前にウイルスのバッチを滴定するために役立ちます。 （ 図3）。 </li><li>セル画を低減するために、lular死、spinfectionの8時間以内にメディアを交換。 注：ウイルス統合および導入遺伝子の発現は、レポーター遺伝子蛍光によって24時間以内に検出可能であるべきである。 （ウイルスは蛍光レポーターを欠いている場合、これは評価するのがより困難であり、成功したトランスフェクションは最高の過剰発現製品のイムノブロット、免疫組織化学または定量PCRによって検証することができます。）全式は3〜7日かかる場合があります。追加のウイルスによる反復spinfectionsは、トランスフェクトされた細胞の割合を増加させるために必要とされ得る。再発spinfectionsは、毎日発生する可能性がありますが、そう頻繁である必要はありません。理想的には、蛍光レポーターを使用している場合、&gt; 80％の細胞が標識されるべきである。 </li></ol> 5.ニューロスフェア遊走アッセイ注：NPCの酵素的解離以下自発的にニューロスフェアの形、 - 細胞はNPC培地中の懸濁液中で培養される場合、（NPC拡張に使用されるものと同一の方法によっては3.3-3.6ステップ）。 <ol><li>簡単に言えば、解離する成長ニューロスフェアを生成するために非接着性のプレートで48時間NPC培地中のdのNPC。 （ 図4）。 </li><li>神経球の移行の場合は、96ウェルプレートに、むしろDMEMなく、ピッキングロスフェアの前に1〜2時間を冷たいNPCメディアを使用して新鮮なマトリプレートを準備します。井戸からマトリゲルを吸引しないでください。 </li><li>もともと胚性幹細胞由来のニューロスフェア22について公表したように、手動で細胞破片を除去するためにNPCのメディアで一度洗浄した後、顕微鏡下でNPC由来のニューロスフェアを選ぶ。マトリゲルコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに一つのニューロスフェアを転送する。 </li><li>各96ウェルプレートにロスフェアに、冷たいNPC培地で希釈さらに0.5 mgのマトリゲルを追加します。 </li><li>手動でもピペットチップを使用しての途中で、個々の神経球をセンタリング。 注：これは、結果のばらつきを低減するために、同様のサイズのニューロスフェアを選択することが重要である。 </li><li>移行が48時間に発生した後、ワット細胞を固定することを許可する目的の免疫組織化学的マーカーを有するi番目の4％パラホルムアルデヒドと汚れ。 </li><li>半径方向の移行は、それらが完全に4倍の顕微鏡対物レンズを使用して、写真のニューロスフェアを決定しようとする場合。ウェルのエッジまたは分析からの第神経球を接触させ、任意の神経球を除外します。 注：マイグレーションがより長い48時間発生した場合は、結果の放射状の移行は可能性が4倍対物レンズを用いた画像に大きすぎることになる。 </li><li> NIH ImageJソフトウェア（ 図5）を使用して、各神経球からの平均の移行を測定します。これは、以下に記載の分析方法のいずれかを使用して行うことができる。 <ol><li>ラジアル移行： <ol><li>手動で結果として得られる形状の面積を計算するために測定します（Ctrl + M）関数を使用するフリーハンド選択ツールを使用して最も遠い移動細胞のエッジをトレース。面積を測定する前にエリアは[分析 ]タブの下に設定し測定ウィンドウにチェックされていることを確認してください。使用してください面積測定、円（A =πR2）の面積についての式の値は、半径（外側）を決定する。 </li><li>オリジナルのニューロスフェアのエッジをトレース、面積を測定し、同じように半径（内側）を計算します。外側と内側の半径との差である総放射状の移行を計算します。 </li></ol></li><li>最大の細胞移動： <ol><li>測定します（Ctrl + M）関数に続く直線選択ツールを使用して内側の神経球の端から5遠いセルの移動距離を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

我々は、NPCのにhiPSCsを区別することによりメソッド、hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が保存された神経細胞の種類を記載しており、それは、潜在的に疾患の病因8に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができる11。私たちは詳細なてきたようにさらに、NPCは確実に複製し、簡単に私たちが病気の素因の分子および生化学的研究のために適切であり得ると信じて神経細胞集団を、形質導入されている。 我々は、前脳、パターン化されたNPCを区別し、培養する方法を詳述してきたが、それらは容易に他の細胞運命にパターニングのNPCを生成するように適合させることができる。フローティングEBを最初に0.5mg / mLのDKK1、10mMのSB431542、0.5 mg / mlのノギン及び1mMのシクロパミンで処理する場合は、海馬のNPCはNPC培地中で拡大し、20 ngのを補充し、ニューロン培地中で分化させることができるが生成される/ mlのWNT3A 7 </suP&gt;。代わりに、100ng / mlのSHH C25II、2Mプルモルファミン、100グラム/ mlのFGF8および3M CHIR99021でFGF2に置き換えることで、NPCが交互にFOXA2-について濃縮ニューロン集団とチロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性を生成することが可能な、中脳ドーパミン作動性の運命にパターニングすることができるニューロン12,23。ほとんどのサブタイプ特異神経分化プロトコルがネスチン及びSOX2、高い正の中間体を介して進行することを考えると、私たちは同じような方法がGABAergic- 2,24のために適合可能と3,25,26特定のNPC集団をglutamatergic-ことを予測する。 注目すべきプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。過剰発現または内因性の遺伝子発現をノックダウン、それは記者が可変サイズのベクターから発現されたときに我々は、蛍光の大幅な違いを観察しているように、同じウイルスのバックボーンからの蛍光タンパク質を発現する対照ベクターを使用するのが最適である場合にはまず、（による減少したパッケージング効率にベクトルの大きさを有する）または差分プロモーター（プロモーターの効率の違いに起因する）を有する。第二に、私たちは密な神経球構造にウイルスベクターの貧弱な浸透度を観察しているように、形成の神経球の前にウイルス導入を完了することをお勧めします。第三に、流路10を超えてのNPCが増加の通過数として、私たちはしばしばロスフェアアッセイにおいて実質的に損なわれ、移行を観察します。実際には、通路とアストロサイトの大きな割合を得たNPCの傾向を考えると、それは各実験においてNPC線の通路と一致することが重要である。 最後に、説明される技法の生物学的および技術的な制限を考慮することが重要である。 NPCには、目で形態学的に類似しているように見えるが、それらは、グルタミン酸とGABA作動性ニューロンの両方を生成することが可能な細胞で構成される不均質な集団である。我々は、このメトを使用して個人間のNPCラインの著しく一貫性のある前脳のパターニングを観察しながら、d 1は 、この場合にのみ、完全に検証され、高品質のNPCの行を比較する-良い品質の低いNPC線との間に実質的な違いがある。さらに、ウイルス形質導入利回り遺伝的に異種の細胞、ユニークなゲノム位置でのウイルスベクターの統合それぞれ。したがって、個々の細胞が両方のゲノム組込み部位の位置および数が変化することになる。遺伝子操作は、それが、ジンクフィンガー、TALENまたはCRISPRベースの戦略によって発生するかどうかを、正確かつ定義された位置をターゲットにされたときに、遺伝子発現のより一貫性の変化は常に発生します。 患者hiPSC導出のNPCは、神経疾患において生じる全体的な遺伝子発現の摂動と健康なまたは疾患患者由来の神経細胞のいずれかとの関連において候補遺伝子またはマイクロRNAを操作する分子および/または細胞性の両方の効果を研究するために使用することができる。このようにしての結果は、一つ以上のキーを操作するリスク対立遺伝子（単数または複数）は、多様な遺伝的背景との関連で特徴付けることができる。

我々 1ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からインビトロで分化したニューロンおよびその他2,3の遺伝子発現研究は、hiPSCニューロンは、胎児ではなく、成人の脳組織に似ていることを示している。現在では、hiPSCベースのモデルではなく後期の特徴、神経疾患より、素因の研究のため、より適切な場合があります。我々は以前のNPCは、統合失調症1に貢献する分子経路を研究するために有用な細胞型であり得ることを示している、統合失調症hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が、統合失調症のhiPSC由来神経前駆細胞（NPCの）に保存されていることを報告している。我々は、他の統合失調症hiPSCのNPC 1,4-6における酸化ストレスおよび活性酸素種、サブスレッショルド環境ストレスに対する感受性およびミトコンドリア機能障害の増加、ならびにニューロンcと減少し、異常な移行が報告されているonnectivityと統合失調症のhiPSCニューロン5,7-10におけるシナプス機能。統合失調症hiPSC NPCの中で異常な移動及び/または酸化ストレスに貢献する分子の要因も統合失調症hiPSC由来の神経細胞における減少し、ニューロンの接続性の根底にある場合は、NPCが疾患の原因のメカニズムを研究するために、堅牢性の高い複製神経細胞集団である可能性があります。一つは、急速に多数の細胞を生成することができるし、ニューロン成熟のために数週間または数ヶ月待つ必要がないので、さらに、NPCベースのアッセイは、より大きな患者コホートの研究に適しており、ハイスループットスクリーニングにより適している。我々はすでに統合失調症1およびハンチントン病11のように多様な疾患において実証されているようにhiPSCのNPCは、潜在的に疾患の病因に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができると信じている。 hiPSCs、の初期の神経からのNPCを区別するために生産は、デュアルSMAD阻害（0.1mMのLDN193189および10mMのSB431542）12によって達成される。これらの小分子とシグナリングBMPおよびTGF拮抗することにより、内胚葉および中胚葉の指定は、神経分化を促進し、めっきの一週間以内に目に見える神経ロゼットの形成をもたらす、遮断される。神経パターニングは、おそらく神経ロゼット形成の期間中とその直後に、早期にこのプロセスで発生します。他の手がかりがない場合には、これらの原始的な神経細胞は、前前脳のような運命13を想定しています。すぐにNPCの拡大を通じて、神経ロゼット形成以下、および継続的な、前脳NPCはFGF2 8,14と培養される。これらは、二重系統可能性を有し、70〜80％のIII-チューブリン陽性ニューロン及び20-30％グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） -陽性星状細胞（ 図1）の神経集団に分化させることができる。前脳のhiPSCニューロンの大半はVGLUT1陽性であるニューロンの約30％が、GAD67陽性（GABA作動性）であるが、したがって、おそらくグルタミン酸である8。 NPCは日常的に一貫性の分化プロファイルを維持し、核型異常を蓄積することなく、一方、in vitroで 10回以上継代する。グループが40倍以上15のNPCを継代報告している、しかし、私たちは10継代を超えて、NPCには、アストロサイト分化に増加傾向を示していることがわかります。 NPCは、複数の凍結融雪、よく耐え単に非接着プレートで培養することにより、ニューロスフェアとして成長に移行することができます。 NPCは、効率的に生化学的研究のために十分な材料を得るために急速な遺伝的摂動の分子·細胞影響の評価、および容易に拡張を可能にする、ウイルスベクターによって形質導入されている。ウイルスベクターの過剰発現及び/又は疾患関連遺伝子のノックダウン堅牢許すのでさらに、コントロールまたは患者のいずれかでneur由来らの細胞は、1つは、これらの操作上の遺伝的バックグラウンドの効果を試験するために、このプラットフォームを使用することができる。成熟した神経細胞を必要とするシナプスまたは活動に基づくアッセイに適していないが、NPCは、患者由来の神経細胞の多くの単純な分子または生化学分析のための実用的な代替手段かもしれません。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>for HES media</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>for neural media</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#17502-048</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#12587-010</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Resuspend in PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;#450-10</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;#D0627</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>Resuspend in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&amp;nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, Natural Mouse 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent</td></tr><tr><td>Tissue culture treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-Sox2&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc&amp;shy;17320</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>mouse anti-human Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>rabbit anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>PRB&amp;shy;435P</td><td>use at 1:500</td></tr><tr><td>mouse anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>MMS&amp;shy;435P</td><td>use at 1:500</td></tr><tr><td>mouse anti-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>Plate centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

ニューラルロゼットapico -基底極性の神経上皮細胞のラウンドのクラスターとしての特徴的な外観（ 図1）により、明視野顕微鏡を用いて、形態学的に同定することができる。 NPCは、非常に高い細胞密度で典型的に培養されても、すぐに継代の後、わずかに錐体状の細胞体と双極神経構造が見える（ 図1D）である。 IIIチューブリン染色はNPCの一部の割合が絶えず文化（ 図1F）内の神経分化を開始していることを示す、すべてのNPC集団においても見えるけれども検証済みのNPCは、細胞の大部分でネスチン及びSOX2を発現する。そのようなLmx1aのとFOXA2として中脳マーカーが（ 図1G-I）ではないが、このようなSOX2とPAX6、及びそのようなTBR2などの前脳の神経前駆細胞、などの神経幹細胞のマーカーは、また、NPCの中で表現されている。大規模フラット線維芽細胞様細胞のかなりの割合以内<html> NPC集団は、神経分化（ 図2）は、以下の多数のニューロンを生じる可能性が低いもの、低品質のNPCが生成されたことを示している。 細胞の80％を超える高力価レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターで形質導入に成功し、次は蛍光レポーターにより標識されるべきベクター（ 図3）に含まれる。ニューロスフェアの生成は、定期的な給餌で、約1週間培養中に健康を維持することができ、比較的均質なサイズのニューロスフェア（ 図4）、の人口が得られるはずです。ニューロスフェアの移行は健康ロスフェア（ 図5）に確実に発生し、hiPSCのNPCは神経球遊走アッセイ1の過程で急速な分化を受ける。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52495/52495fig1highres.jpg" />10トン&quot;&gt; 図1の患者固有hiPSCs、のNPCとニューロン。hiPSC神経分化の明視野画像を、胚様体（B）、神経ロゼット（C）、NPCの（D）及びニューロンhiPSCs（A）から（E） 。。。、100倍、スケールバーは100μmFI hiPSC NPCはNPCマーカーであるネスチン（緑色）およびニューロンマーカーIII -チューブリン（赤）（F）を含む前脳の神経幹細胞および神経前駆細胞マーカーの数、陽性である。なく、中脳マーカーLmx1aの（緑）及びFOXA2（赤）（I）と、前脳前駆細胞マーカーTBR2（赤）（H）;神経幹細胞の転写はSOX2（緑）、PAX6（赤）（G）の係数。 DAPI染色された核（青）。100X、スケールバーは100μm。J。NPCには（70から80までパーセントIIIチューブリン陽性ニューロン（緑）、20から30パーセントグリア線維性酸性タンパク質にGFAを区別することができますP）陽性星状細胞（赤）。 200X、スケールバーは100μm。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52495/52495fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52495/52495fig2highres.jpg" /> 図2.検証NPCラインズ。高品質（左上）hiPSCのNPCはネスチン（赤）とSOX2（緑）を発現する。ほとんどの細胞（核はDAPI（青）で染色した）で、低品質のに対し、（左下）NPCはSOX2陰性およびネスチン陰性細胞（右）のパッチを持っている。高品質のNPCから分化した4週齢のニューロンはMAP2AB（緑）、III-チューブリン（赤）（右上）を発現するが、低品質のNPCから分化したものが（右下）しない。 100X、スケールバーは100μm。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52495/52495fig2large.jpg" target="_blank">で拡大表示するには、ここをクリックしてくださいVE</a>この図のrsion。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52495/52495fig3highres.jpg" /> NPCは。明（上） の図3.ウイルス導入およびGFP蛍光（下）前（左）と、ウイルスspinfection後のhiPSCのNPCの画像。 100X、スケールバーは100μm。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52495/52495fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52495/52495fig4highres.jpg" /> 図4.ニューロスフェア形成。接着性のNPC（左）と新たに形成されたニューロスフェア（右）の明視野像。 100X、スケールバーは100μm。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52495/52495fig4large.jpg" target="_blank">LARを見るにはこちらをクリックしてください</a>この図のGER版。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52495/52495fig5highres.jpg" /> 5.ニューロスフェアの移行図。 AB。明の前にニューロスフェアの画像（A）と（b） の後マトリゲルでの移行の48時間。 100X、スケールバーは100μm。CG。画面キャプチャ画像NIH ImageJソフトウェアを使用して放射状の神経移行を分析するための方法論を実証する。 ImageJのツールバーの「フリーハンドの選択」（C）をクリックします。ニューロスフェア（D）の周りに遠い移動した細胞のエッジをトレースします。 領域が設定測定窓 （E）にチェックされていることを確認してください。 測定機能 （Ctrlキー+ M）（F）を使用します。 （元のニューロスフェア（G）のエッジをトレースし、 測定機能を使用Ctrlキー+ M）。測定は、分析のためにExcelにエクスポートすることができます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52495/52495fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> メディア </td><td> コンポーネント </td></tr><tr><td> HESメディア </td><td> DMEM / F12（Life Technologies社＃11330） </td></tr><tr><td></td><td> 20％のKO-血清代替（ライフテクノロジーズ＃10828） </td></tr><tr><td></td><td> 1Xグルタマックス（ライフ·テクノロジーズ＃35050） </td></tr><tr><td></td><td> 1X NEAA（ライフ·テクノロジーズ＃11140） </td></tr><tr><td></td><td> 1X 2-メルカプトエタノール（55ミリメートルの1000倍）（ライフテクノロジーズ＃21985から023） </td></tr><tr><td></td><td>を20ng / mlのFGF2（ライフテクノロジーズ13256から029） </td></tr><tr><td> N2 / B27メディア </td><td> DMEM / F12（Life Technologies社＃10565） </td></tr><tr><td></td><td> 1X N2（ライフ·テクノロジーズ＃17502から048） </td></tr><tr><td></td><td> 1X B27-RA（ライフ·テクノロジーズ＃12587から010） </td></tr><tr><td> NPCメディア </td><td> DMEM / F12（Life Technologies社＃10565） </td></tr><tr><td></td><td> 1X N2（ライフ·テクノロジーズ＃17502から048） </td></tr><tr><td></td><td> 1X B27-RA（ライフ·テクノロジーズ＃12587から010） </td></tr><tr><td></td><td> 20ng / mlのFGF2（Life Technologies）を</td></tr><tr><td></td><td> 1 mg / mlのナチュラルマウスラミニン（ライフ·テクノロジーズ＃23017から015） </td></tr><tr><td> ニューロンメディア </td><td> DMEM / F12（Life Technologies社＃10565） </td></tr><tr><td></td><td> 1X N2（ライフ·テクノロジーズ＃17502から048） </td></tr><tr><td></td><td> 1X B27-RA（ライフ·テクノロジーズ＃12587から010） </td></tr><tr><td></td><td> 1 mg / mlの天然マウスラミニン（Life Technologies）を</td></tr><tr><td></td><td> 20ng / mlのBDNF（Peprotech社の＃450-02） </td></tr><tr><td></td><td> 20ng / mlのGDNF（Peptrotech＃450から10） </td></tr><tr><td></td><td> 500 / mlのジブチリルサイクリックAMP（シグマ＃のD0627） </td></tr><tr><td></td><td> 200 nMのL-アスコルビン酸（シグマ社＃A0278） </td></tr></tbody></table> 表1.メディアのレシピ。

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A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

18.2K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

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Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

発生生物学

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

免疫・感染学

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

神経科学

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Differentiation of Porcine Induced Pluripotent Stem Cells (piPSCs) into Neural Progenitor Cells (NPCs)

iPSC-derived neurons are attractive in vitro models to study neurogenesis and early phenotypic changes in mental illness, mainly when most animal models used in pre-clinical research, such as rodents, are not able to meet the criteria to translate the findings to the clinic. Non-human primates, canines, and porcine are considered more adequate models for biomedical research and drug development purposes, mainly due to their physiological, genetic, and anatomical similarities to humans. The swine model has gained particular interest in translational neuroscience, enabling safety and allotransplantation testing. Herein the generation of porcine iPSCs is described along with its further differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The generated cells expressed NPC markers Nestin and GFAP, confirmed by RT-qPCR, and were positive for Nestin, b-Tubulin III, and Vimentin by immunofluorescence. These results show the evidence for the generation of NPC-like cells after in vitro induction with chemical inhibitors from a large animal model, an interesting and adequate model for regenerative and translational medicine research.

Differentiation of Porcine Induced Pluripotent Stem Cells piPSCs into Neural Progenitor Cells NPCs

This protocol describes a method for chemical differentiation and culture of neural progenitor cells derived from porcine induced pluripotent stem cells (piPSCs).

iPSC-derived neurons are attractive in vitro models to study neurogenesis and early phenotypic changes in mental illness, mainly when most animal models ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

血液由来神経細胞のGMフリー生成

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first advent, protocols have been continuously optimized and are now widely used in research and drug development. However, the very long duration of these conventional differentiation and maturation protocols and the increasing demand for high-quality hiPSCs and their neural derivatives raise the need for the adoption, optimization, and standardization of these protocols to large-scale production. This work presents a fast and efficient protocol for the differentiation of genetically modified, doxycycline-inducible neurogenin 2 (iNGN2)-expressing hiPSCs into neurons using a benchtop three-dimensional (3D) suspension bioreactor.
In brief, single-cell suspensions of iNGN2-hiPSCs were allowed to form aggregates within 24 h, and neuronal lineage commitment was induced by the addition of doxycycline. Aggregates were dissociated after 2 days of induction and cells were either cryopreserved or replated for terminal maturation. The generated iNGN2 neurons expressed classical neuronal markers early on and formed complex neuritic networks within 1 week after replating, indicating an increasing maturity of neuronal cultures. In summary, a detailed step-by-step protocol for the fast generation of hiPSC-derived neurons in a 3D environment is provided that holds great potential as a starting point for disease modeling, phenotypic high-throughput drug screenings, and large-scale toxicity testing.

This article describes a protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a benchtop 3D suspension bioreactor.

3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...