Name: isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes at JoVE.com

This work was supported by the DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, German Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, collaborative research center). 
Thanks to Hans-Holger G&#228;rtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Germany, for technical support.

この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。 1細胞の単離 1.1大腿骨と脛骨の調製を<ol><li>閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。 </li><li>エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。 <ol><li>鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。 </li><li>鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。 </li><li>前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。 </li></ol></li><li>洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。 注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために無菌でなければならない。 </li></ol>骨髄の1.2収穫<ol><li>大腿骨と脛骨のシャフトへのアクセスを得るために細かいハサミで各骨の近位端および遠位端をカットします。これらの骨は非常に簡単に壊れているため、このステップには注意してください。 </li><li>温かい培地で骨をフラッシュする（M199 + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。無菌の28-G針、1ミリリットルの注射器、10〜15 mlの培地あたりの間に使用しますすすぎのための骨。 </li><li>細かい鉗子で骨を持ち、それが半透明に変わるまで一つ一つをすすぐ。注意深く細胞ストレスを最小にするために、シリンジプランジャの端部に圧力を加える。 </li><li> 70μmのナイロンウェブを通じて骨髄を濾過し、ろ液を集める。骨髄の最大量を抽出するために、遠位端と近位端から繰り返しすすぐ。 </li><li> PBSでふるいをすすぎ、ろ液を集める。慎重に穏やかに撹拌し、ピペッティングにより破片や携帯コングロマリットを取り除く。 </li></ol> 1.3栽培<ol><li> RTで10分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。上清を捨て、約25ミリリットルの培地で細胞を懸濁します。一回繰り返します。 </li><li>第2洗浄工程の後に培地6mlの中に細胞を再懸濁する。パンブルーの50μlの細胞溶液50μlを混ぜる。光学顕微鏡下で計数チャンバー内の細胞を数える。数cを計算するこの式を使用して、溶液中のエル： <img alt="式1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li>プレートの底に永久的な付着を防止するために、6ウェルの超低取付面板上に細胞を播種する。ウェルあたり最大6 mlの1mlあたり10 6細胞の濃度を使用してください。 </li><li>細胞分化を促進するために20ng / mlのM-CSFとの懸濁液を補う。 </li><li>培養物を37℃で5日間、細胞を、5％の二酸化炭素とを毎日観察する。 </li></ol>細胞の1.4収穫注：これらの手順は、氷上で行われるべきである。それに応じて1.4.1または1.4.2のどちらかに進みます。 <ol><li>この時点で、彼らは、超低取付面板であっても、培養プレートに付着する分化したマクロファージを含む、全体の培養を収穫する。 <ol><li>穏やかなピペッティングにより全体の文化を収穫し、4℃、PBの溶液で脱着S、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA。わからない場合には、顕微鏡下で確認する - プレートが接着細胞を残りの明確になるまで繰り返します。 </li></ol></li><li>別の方法として、主に単球が含まれている懸濁液中の細胞と上清を収穫することにより、接着性マクロファージを捨てる。 <ol><li> EDTA非含有PBS溶液と0.5％BSAと非接着細胞を回収。穏やかに付着したマクロファージを追い出し避けるためにあまりにも多くの力を加えないでください。 </li></ol></li></ol> 1.5 FACS-解析（オプション） 注：これは、MACSを用いてCD117 +ステムおよび前駆細胞の細胞懸濁液を枯渇させることが可能である。この手順については、製造元のプロトコルを使用してください。 <ol><li>どちらかが1.4.1または1.4.2の手順に従って、細胞を採取する。 </li><li> 4℃で10分間250×gで細胞を遠心して、もう一度この手順を繰り返します。 </li><li> FACS bの300μlの中に再懸濁し、少なくとも250,000細胞プローブあたりuffer。 </li><li> 96ウェルプレート（ウェルあたり30μL）の上に細胞溶液を転送します。 </li><li> 4℃で5分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。 </li><li>上清を除去し、各ウェル（使用メーカー希釈）に対する抗体の25μlを添加する。 </li><li>抗体と細胞（1.5.1-1.5.6ステップ後の細胞表現型のために製造業者のプロトコルを以下のように染色。単球/マクロファージの同定のために一般に使用されるマーカーは、CD11bの、F4 / 80（ 図3）、CD115（図2）、およびGR-を含む1。 注：セル·ソリューションのさらなる説明については、CD4、CD8a、のCD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G、およびCD192のようなマーカーの使用が推奨されます。細胞の特徴は、以前に12を説明した。 </li><li> 4℃で20分間、プローブをインキュベートする。 </li><li>遠心機で4℃で5分間250×gでプローブし、FACS緩衝液200μlに再懸濁とは目を繰り返しますステップの2倍である。 </li><li> FACSチューブにプローブを転送し、FACS分析12を行う。 </li><li>細胞分化を分析するために、0日目、3及び5にFACS分析12を実行する。 </li></ol> 2.尾静脈注射 2.1準備<ol><li>約10分間37℃で加熱板上で動物を暖める。過熱の兆候を認識するために温めながら、動物を観察します。 </li><li> NaClを150μlの中で、ステップ1.1〜1.4で孤立し、単球を再懸濁し、30Gの針を1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードします。軽くすべての球が注入されるように、注射器をロードする前に解決策をボルテックス。常に熱媒介アタッチメントと単球の活性化を避けるために、氷上で細胞を処理します。 </li></ol> 2.2保全処分<ol><li>静脈内注射のためのマウスを選択する際にケージ内の他のマウスを乱すことは避けてください。 </li><li>制止にマウスを置きます。あまりにも多くのPRを避けるessureと後肢に注意してください。 （ 図4） 注：または、動物のストレスのないハンドリングを保証するために全身麻酔を使用しています。 </li><li>マウスが制止を閉じる前に、呼吸のためのスペースがあることを確認してください。 </li></ol> 2.3インジェクション<ol><li>消毒剤と、注射部位を消毒する。マウスの尾にスプレーし、少なくとも1分間放置。 </li><li>静脈の視認性のために、注射部位の上に外側尾側に緩やかな圧力を加えることにより、尾の静脈血の流れを止める。 </li><li>注射の前に、尾を90度回します。 （ 図5） </li><li> 45度の角度で注入する。動物に害を避けるために、ゆっくりと何グラムあたり5μL以上の注入ません。 </li><li>失敗した注射のサインですブリスターがある場合は、すぐに中止し、より近位に注射を繰り返します。 </li><li>穏やかなページを適用することにより、射出側の出血を止める約1分間の案内圧力スイッチ。 </li><li>手順の最後に、リトラクターを開き、そのケージにマウスを置く。 </li><li>動物が注射によって害されませんでしたし、胸骨の横臥が維持されることを保証するために20分間、マウスを観察します。マウスが十分な意識を取り戻すまで、観測の時間を延長します。それは完全に回復した後にのみ、他の動物の会社にマウスを返します。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 6の単球収率5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 6±3×10 6単球のより高い収率を得ることができる。 この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を言及することが重要である。すすぎ後の洗浄工程が適切に従わない場合は、細菌および真菌による汚染可能性が高いです。さらに、骨髄は顆粒球、リンパ球および赤血球系細胞を含む不均一な細胞懸濁液、で構成されています。通常、これらの細胞は、増殖因子の欠如のために2日培養の3との間に消える。成長因子駆動型分化した後、マクロファージは、汚染の主な原因である。トンを維持するためにマクロファージへの単球の分化を最小限に抑えるために、低およびマクロファージの彼数は、超低付着性プレートと、上述した洗浄工程の使用が重要である。 これは、排他的に単球に特異的であるマーカーを同定することは困難である。マーカー間の干渉は、複数のマーカーの使用を必要とし、可変性は、細胞懸濁液を分析する粒度及び細胞の大きさである。 図1-3に示すマーカーと説明は、培養中の代表的な細胞型のための良い選択肢である。これは、5日目のためにはCD115及びF4 / 80のような他のマーカーを使用することが重要であり、特に後、種々の細胞型を区別することは困難である。 接着性のない条件下での骨髄細胞の拡大を考慮すると、マクロファージの分化を長くすることができる未分化単球を蓄積することができる。マクロファージの分化は、汚染を示している。しかし、デュ唯一の培養物からの非接着細胞を回収しながらでも、超低付着培養表面にその接着性質eは、それらが容易に廃棄することができる。以前の実験1,3では、マクロファージによる汚染は深刻な臨床的副作用をもたらしていない。細胞移植後のマウスの臓器や筋肉の組織学的精密検査は、注入されたマクロファージは、脾臓、肝臓や肺などの臓器に同化することを示した。これらの器官におけるマクロファージの同化は、マウスにおいて観察可能な臨床効果を示さなかった。これらのマクロファージによってトリガー分子機構はさらなる調査のための興味深い質問することができます。 全身に適用された場合、単球などマクロファージは、特に、末梢動脈疾患で動脈形成に影響を与える。そのような塞栓症または大量の全身性炎症の臨床副作用があっても250万人以上の単球の注入後に観察されなかったが、これらの細胞は、炎症および経口をトリガすることができtentially重篤な全身作用を引き起こす。ヒト試験では、これらの効果は、臨床的意義を有する可能性が高い。動脈のトリガは、腫瘍増殖または糖尿病性網膜症、および今後の研究で検討されるべきで注入された細胞溶液のような可能な全身作用に影響を与えることができる。 以前の刊行物は、骨髄からの単球の特性は、末梢血細胞から単離されたものとは異なることができる理由を説明する末梢、血液及び骨髄由来単球の特性の違いを説明する9。 単離方法は、同様に臨床興味深い。採血の代わりにヒト骨髄を抽出し、臨床医学の文脈でより実用的である。それは、動物の福祉の世話をするために、必要に応じて鎮痛を適用することが重要である。静脈内注射のためには、動物と同時に、注射器の両方を扱う実践することが重要である。シングルANIの場合MALは、静脈の品質と尾の皮膚が苦しむ、複数回の注入を受けている。 これらの欠点にもかかわらず、この方法は、単球の挙動および特性を研究するのに非常に有用である。アテローム性動脈硬化症、免疫や炎症の分野での実験は、この方法から利益を得ることができる。わずか30分で、6ウェルの超低取付面プレート上の細胞の播種に骨髄の抽出から必要とされる。このプロトコルの高い収率が細胞ドナーとして必要な動物の数を最小化するため、倫理的な問題は、最小化される。この新しい方法は、単球を含む多くの研究のために参考になります。 我々は、単球の移植を介して、側副血管成長の治療の増強に焦点を当ててきた。動脈形成の増強のための単一の要因のアプローチが入り混じった結果13,14を生成した理由を、このプロセスの多因子性質が説明できるかもしれない。これは、中につながっている細胞ベースの治療のvestigation。自家骨髄由来の幹細胞および前駆細胞は、移植のための潜在的な細胞として同定されているが、中程度の臨床的利益は15報告されている。投与量、単離方法、および投与経路の研究に加えて、さらなる研究が依然として最適な細胞タイプを決定するために必要とされる。自家細胞移植の欠点は、先天的および/または適応免疫応答を活性化することができないこととすることができ、両方が動脈形成のために重要である。局所炎症を増加させると、動脈16のための最高の刺激を表すことができる。 全身性の薬物送達が所望される場合、単球の静脈内注射は、マウスモデル内の細胞移植のための一般的な方法である。なぜなら、全身効果のため、副作用は同様に起こり得る。静脈注射をターゲットにしていることを確認してください。それは、特に重く色素性マイクを注入し、動脈と静脈を、混同することが一般的であるE。動脈注射は、循環における全身の問題につながる塞栓を引き起こす可能性があります。

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies4,5 and cancer research6,7.
Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood8 is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS9 when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.
Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 106 &#177; 3 x 106 cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.
For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

<table><tbody><tr><td>6-well-ultra-low-attachment plate</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td>6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile</td></tr><tr><td>8- 12 week old, male, balb/c mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue dead cell stain</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>GE Healthcare, Freiburg, Germany</td><td></td><td>Fraction V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>With cap, steril</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td>Allegra&amp;reg; X-15R centrifuge</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet, Mannheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disinfection agent</td><td>Sch&amp;uuml;lke&amp;amp;Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>Disposable scalpel No.10&amp;nbsp;</td><td>Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%&amp;nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&amp;uuml;cken, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extraction unit Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co.KG, Eberstadt, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td>Manufactured by our group with single components</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>FACS device</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; pipette</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Rubis, Stabio, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>R&amp;ouml;sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Heating plate&amp;nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&amp;ouml;ttingen, Germany&amp;nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>Axiovert 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Macrophage-Colony Stimulating Factor</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp;amp;region=DE&quot;&gt;SRP3110&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical shaker</td><td>IKA, Staufen, Germany</td><td></td><td>ms2 minishaker</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Micro test tubes</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological work bench</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Monocyte wash buffer&amp;nbsp;</td><td>Manufactured by our group with single components</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(sodium acide)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon cellsieve</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m mesh size</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td></td><td>pH 7.4, sterile</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td>10&amp;micro;l/100&amp;micro;l/200&amp;micro;l/1,000&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Pipetting heads</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Suction unit</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germany</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>1 ml Omnifix&lt;sup&gt;&amp;reg; &lt;/sup&gt;-F insuline syringe</td></tr><tr><td>Tubes with cap</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15 ml/50 ml Cellstar tubes</td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存しなければならない。 MPS-系の細胞を同定するために使用される最も重要なマーカーは、M-CSF受容体として機能し、特に単球前駆細胞、単球およびマクロファージ上に発現されるCD115である。したがって、独特のMPS-サブセットを識別するために使用されないかもしれないが、確実に、単球/マクロファージ分化に打ち込ま細胞の絶対量を推定することができる。異なる中のCD115発現をタイムラインについては、図2を参照してくださいentiation。 成熟マーカーF4 / 80は、若年性単球、成熟した単球、およびマクロファージを区別するのに便利です。マクロファージは、マーカーに対して陰性である単球前駆細胞を、少年と比較して、F4 / 80の強力な発現を示す。成熟した単球をF4 / 80の中間の発現を示す。したがって、CD115及びF4 / 80マーカーの組み合わせは、（ 図3を参照）、細胞分化を定量化し、監視するための実行可能な方法を表している。 CD115及びF4 / 80の組み合わせは、従来のセルの適用ルーチン培養観察および品質管理のために十分である。培養の5日目に骨髄由来単球のより詳細な検査は、末梢血単核球12のものに一致それらの構造的および機能的特性を確認する。 これは、尾の張力を避け、拘束具に慎重にマウスを修正することが重要です。 freedoを制限注射を容易にするために、呼吸阻害することなく、可能な限りの移動メートル。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52347/52347fig1highres.jpg" /> 図1の左パネル：培養中の1日目に細胞型の構成細胞型は、リンパ球、単球および顆粒が挙げられる。右パネル：培養中にシフトする細胞組成に注意してください。細胞集団は、単球およびマクロファージが含まれています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52347/52347fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52347/52347fig2highres.jpg" /> 分化中のCD115の発現図2.タイムライン。全ての細胞の&gt; 95％がその広大なことを示す、分化の5日後にCD115陽性であるノート<html>細胞の大部分は、単球またはマクロファージでのいずれかである。分類は、細胞の大きさと細かさに基づいてすることができますが、特定の細胞マーカーは、より信頼性がある。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52347/52347fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52347/52347fig3highres.jpg" /> / 80球/マクロファージ成熟マーカーF4の発現を増加図3. 5日目：。単球の表現型と一致している中間のF4 / 80発現が、 ​​人口の外観に注意してください。 7日目：マクロファージの成熟と一致して、F4 / 80式の右シフトに注意してください。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52347/52347fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> E 4 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg &quot;/&gt; 図4.マウス尾静脈注射のための拘束装置で固定した。後は慎重にマウスを拘束する静脈は背側に表示されるまで、尾を90度回転させる。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52347/52347fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52347/52347fig5highres.jpg" /> 図5.マウスの尾の概略断面。画像はマウスの尾の血管内の場所を示している。動脈（赤）は、腹と背側の側に位置し、静脈は尾の側面にあるされている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52347/52347fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

isolation-intravenous-injection-murine-bone-marrow-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K ビュー.  Otto von Guericke University Magdeburg. Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

ビデオ: Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

免疫・感染学

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

医学

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

NO-Redox生物学研究のための骨髄由来マクロファージの単離と 体外 培養

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

新生児骨髄由来マクロファージの食作用アッセイ評価 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

著者スポットライト:新生児マウスから骨髄由来マクロファージを分離するための再現性のある方法の開発により、早期の免疫応答を促進

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and development of bones are mainly regulated by osteoblasts and osteoclasts. It has been widely accepted that osteoclasts are derived from bone marrow monocyte-macrophage cells (BMMs). BMMs and other hematopoietic stem cells are located in the bone marrow cavity. Therefore, isolating single stable BMMs from different and heterogeneous cell populations is a huge challenge. Here we present a protocol for the isolation of BMMs from SD rats, called the secondary adherence method. Adherent cells cultured for 24-48 h in primary culture were collected. Flow cytometric analysis showed that approximately 37.94% of the cells were CD11b/c+ (monocyte-macrophage surface antigen). Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining and western blot analysis demonstrated that BMMs could differentiate into osteoclasts in vitro. The above findings suggested that the secondary adherence cells could be considered as a suitable cellular model for osteoclast differentiation research.

Here we present a protocol for the isolation of BMMs from SD rats, called the secondary adherence method.

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

要約

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この動画の章

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

NO-Redox生物学研究のための骨髄由来マクロファージの単離と体外培養

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離

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