Name: modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
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私たちは彼の研究室で撮影を行うことを可能にするためシトリンの魚のラインとビル·ジャックマン：著者は、寛大にαカテニンを提供するための博士ルトリン博士とトービンに感謝。著者は、資金源国立衛生研究所（助成5P20RR016463、8P20GM103423とR15AI094406）とUSDAを認める（プロジェクト＃ME0-H-1-00517-13）。この原稿は、メイン農林試験場公開番号3371として公開されている。

注：すべてのゼブラフィッシュケアプロトコルおよび実験は施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルA2012-11-03下のNIHガイドラインに従って行った。 4日後に受精1.ゼブラフィッシュ飼育<ol><li>別の映像34に示すように、最初の3時間後に受精内、ABゼブラフィッシュ、または任意の他のトランスジェニック系統を収集する。 </li><li> （; 0.17ミリモルのKCl、0.33のCaCl 2、0.33のMgCl 2、2mMのHEPES、pH6.8の5 mMのNaCl）をメチレンブルー（0.3 / mlの最終E3培地150 mlを含む15センチメートルペトリ皿に120の卵をインキュベート12/12の明/暗光周期で33℃のインキュベーター中の濃度）。 </li><li> E3 + PTU（1-フェニル-2-チオ尿素、10μg/ mlの最終濃度）と6時間後にメディアを交換して、死んだ卵を取り除く。 </li><li> 2日後に新鮮なE3 + PTUと交換媒体、33℃で4日間インキュベートする。 </li></ol> 2.でjectionマイクロニードルの準備<ol><li>次の設定で針プラーを使用したマイクロニードルに（110時間550ヒート; 0プル; 130ベロシティ）;（ID 0.69ミリメートル外径1.2ミリメートル）ホウケイ酸キャピラリーを引き出します。 NOTE：設定は、同様の形状のマイクロニードルを得るために、フィラメントからフィラメントに変化するであろう（ 図1参照）、新たなフィラメントがインストールされるたびに再調整する必要がある。 </li><li> 0.4μmのフィルタリン酸緩衝生理食塩水の3μlのマイクロニードルを埋める（; 137のNaCl、2.7のKCl; 10のNa 2 HPO 4; PBS 1.8 mMのKH 2 PO 4; pH7.4）を20μlのmicroloaderピペットを用いて、先端。 </li><li>高圧噴射システムに接続されているマイクロマニピュレータにマイクロピペットホルダー上のマイクロニードルを設定します。 30 PSIへの射出圧力と30ミリ秒のパルス持続時間を設定します。 </li><li>針の1/5が水になるまで蒸留水でペトリ皿を使用して、マイクロニードルを下げる。マイクロニードルのWiクリップちょうど水位以下に目細かいピンセット。水の中からマイクロニードルを持参し、ボーラスが表示されるまで、ペダルを数回押してください。 </li><li>タイプの一滴浸漬油でレイヤード血球計数器上のマイクロニードルを下げてボーラスの直径を測定します。所望の容積を得るために、パルス持続時間を調整する（ 表1参照）。 </li><li>油で安定した状態を保つ（ボーラスは体積が増加した場合、圧力を下げ、ボーラスボリュームが減少した場合背圧を増やす）するボーラスのための背圧を設定します。各マイクロニードルのためのパルス持続時間を記録します。 </li><li> microloaderピペットチップを使用してそれを吸引することによって、微小針からPBSを削除し、インジェクタに戻ってそれを配置し、連続パルススイッチを切り替えることで、左オーバーPBSを追放。各マイクロニードルを予約。 </li></ol> 3. カンジダ準備<ol><li>コドン最適化dTomato、GFP、BFP、EOSや極東で形質転換ストリークカンジダ·アルビカンス酵母peptineデキストロース（YPD）寒天プレート（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロースに滅菌木製のダボを用いて凍結ストック（25％グリセロール中で-80℃のストック）から赤、が20g / L寒天;オートクレーブし、ペトリ皿中を25ml注ぎ）、30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>滅菌木製のダボを用いてつのコロニーを選択し、YPD液体（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロース、オートクレーブし、無菌的に16×150mmのガラス培養において5mlのアリコートを5 mlに植菌管）。 </li><li> 60rpmでローラードラムで30℃で一晩インキュベートする。 </li><li> Cの 1ミリリットルを収集1.7ミリリットル滅菌遠心管にアルビカンス文化と転送。 </li><li>秒のカップルのための5000×gで遠心分離する。上清を空にし、徹底的に滅菌PBS、渦の1ミリリットルを追加します。これを2回繰り返します。 </li><li>滅菌PBS 1,000：1ミリリットル株式1に希釈することにより、血球計数器を使用してコロニーを数える。 </li></ol> 4にゼブラフィッシュを注入する浮袋<ol><li> 33℃のインキュベーター中で30分間注入皿（2％アガロース）を温める。 </li><li>所望の時間に、すべてのゼブラフィッシュを吸引することなく、25ミリリットルピペットを用いて注入するために、魚を含む15センチメートルペトリ皿からE3 + PTUの150ミリリットルの100を削除します。 </li><li> （最終濃度は200μg/ ml）を、残りの50ml培地に4 mg / mlの緩衝化トリカインメタンスルホン酸塩ストック（TR）2 mlを加えることにより、ゼブラフィッシュのdpf 4を麻酔し、15分間待つ。 </li><li>解剖顕微鏡下では、膨張した浮袋で魚を選択します。魚はまた、MPOにおける好中球分布として、均質な表現型のために、その時点でスクリーニングすることができる：解剖顕微鏡落射蛍光を用いて、GFPライン 。 </li><li> C.を希釈PBS中1ml当たり形成単位1.5×10 7コロニー（CFU / ml）を基準にした元濃度（ ステップ3.8）からアルビカンス株式を。 </li><li>プラスチック製の移送管を用いて射出皿30ゼブラフィッシュを転送するTTEとは余分なメディアを取り出します。 </li><li>釣りワイヤツールを使用すると、（0.012インチ径釣り糸ホウケイ酸キャピラリー内にスーパー接着）、垂直方向に注入ディッシュを保持し、垂直方向に魚を方向付けることで、10匹の魚の3行を作る。 </li><li>余分なメディアを取り出します。 </li><li>徹底的に1.5×10 7 CFU / mlのCでチューブをボルテックスアルビカンス 。 </li><li> Cの 3μlの1のマイクロニードルを埋めるアルビカンスが新しいmicroloaderピペットチップを使用して、適切な設定にパルス持続時間を設定する（ ステップ2.9参照 ）。 </li><li>浮袋（ 図3A）の背面に向かって目指して、マイクロニードルと魚の頭の間に20°の角度を作るために、注入の皿を回します。 </li><li>針の穴がルーメン内にあることを確認しながら、浮袋にマイクロニードルを押し、一度ペダルを押してください。 </li><li>各魚を繰り返し、E3で料理をあふれさせることで回復皿（25ミリリットルE3 + PTU）に移転Dリカバリー皿にそれを空に。 </li><li>注射皿に別の30魚を転送します。 </li><li>徹底的にC.ボルテックスで満たされた新しいマイクロ針で繰り返し注射アルビカンス 。 </li><li>必要に応じて、汚染を避けるため、別の回復皿（ ステップ4.10）に転送するために異なる注入の皿を使用して、PBS対照を注入して終了。 </li></ol> 5.目的の接種のために魚のスクリーニング<ol><li>溶解するまでマイクロ波処理し、37℃に冷却し、沸騰、E3 40mlのアガロース低溶融物160mgを加えることにより、0.4％低融点アガロース溶液（LMA）を40mlを準備する。一旦冷却TR（最終濃度200μg/ ml）を400μlのを追加します。 </li><li> （25 mLのE3 + PTU、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているようで30分の回復後、魚を麻酔し。 </li><li>体重ボートでLMAの2ミリリットルに転送（できるだけメディアとの）30魚。 </li><li>トランスファーピペットで吸引し、個々の魚とのみ10×6中央井戸を使用して、96ウェルイメージングプレートにLMAの1滴の魚プレート。 </li><li>画面にすべての魚は、イメージングプレートにロードされるまで繰り返します。 </li><li>媒体を5分間室温で固化しましょう​​。 </li><li>彼らはガラスの底に接触していることを確認しながら、彼らの側に魚を置きます。 </li><li>倒立落射蛍光/共焦点顕微鏡および適切なフィルターで20X対物レンズを用い、C.数を記録する各魚の浮袋でアルビカンス酵母細胞。 </li><li> 、浮袋で15-25酵母細胞魚（または所望の接種材料）を選択して安楽死させる非選択魚（E3におけるTRの800μgの/ mlで）によってE3 + PTU 50mlの深いペトリ皿に選択された魚を戻すイメージングプレート選択したウェルにE3の3滴を追加し、プラ​​スチック製のトランスファーピペットを用いて魚を吸引する。 </li><li>所望の期間のために、33℃でインキュベートする。 </li></ol> 6.魚ポストスクリーニングイメージング<ol><li>所望の時間に、イメージに魚を含む深いペトリ皿からE3 + PTUメディアの50ミリリットルの25を削除します。 </li><li> （25ミリリットルE3 + PTU残り、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているような魚を麻酔し。 </li><li>適切96ウェルイメージングプレート及び位置に魚プレート（ - 5.7 5.3ステップ ）。 </li><li>適切なレーザーおよび発光フィルターを使用して共焦点顕微鏡を走査して画像。微分干渉コントラスト（DIC）の下で4倍対物レンズを用いて魚に第1焦点と第2マイクロ秒/ピクセル速度および1024×600ピクセルのアスペクト比を有する走査モードで共焦点レーザーで20X対物レンズを用いて関心領域の画像を取得する。 3フレームのカルマン·フィルタモードを適用し、1μmのステップサイズでのZスタックを取得する。 </li><li> 50ミリリットルE3 + PTUまたはindividuaに深くシャーレに戻るリットルウェル（24ウェル培養皿を3ml E3 + PTU）と33℃でインキュベートする。 </li></ol> 7.浮袋を解剖<ol><li>高真空グリースで10ミリリットル注射器を埋める。 </li><li> 2％のLMA（アガロースE3の8ミリリットル中の低融点の160 mgのと歩調5.3）を準備します。 </li><li>所望の時間に、魚（ ステップ5.2）を麻酔し。 </li><li>転送10 E3 1mlの1.7 mlの遠心管に魚や遠心管に4 mg / mlのトリカイン（最終濃度800μg/ ml）を200μlを添加し、室温で15分間インキュベートすることによって安楽死させる。 </li><li>マイクロスライド（75×25ミリメートル、 図2）に1センチメートル離れて、広場に真空グリースの4滴を配置することにより、画像化スライドガラスを準備します。 </li><li>広場の真ん中に2％のLMAの2滴を置きます。 </li><li>解剖顕微鏡下で独立したスライドガラス上に1魚を置き、心臓が鼓動を停止していることを確認して、余分な水分を除去する。 </li><l細かいピンセットを使用してI&gt;は左ピンセットで固定された位置に頭を維持し、右のピンセット（ 図4A）で、前腸を下に引っ張って浮袋を分析。 </li><li>消化管からそれを分離し、左ピンセットで空気圧ダクトによる浮袋をピックアップし、それが固化する前に、2％のLMAの中心に配置します。 </li><li>イメージングスライドガラスの上にカバースリップ（18×18 mm）を置き、真空グリースなどLMA（ 図2）に触れるまで押し込みます。 </li><li>切開の10分以内に画像がステップ6.4で説明したように。 手順を繰り返し7.7から7.11他の魚と。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

浮袋のマイクロインジェクション疾患モデルの進歩と限界ここで紹介するモデルは、Gratacap らに記載粘膜カンジダ症浸漬モデルの拡張である（2013）。それは、制御された感染時間、再現性の高い感染量、したがって、改善された効率の利点が追加されます。ここでは、非侵襲非常に詳細に感染動態の時間的なドキュメントだけでなく、より高解像度浮袋のex vivoイメージングを可能にする新しい方法を実証する。これらの手順は、Cの研究を促進すべきであるアルビカンスは、粘膜の免疫系の相互作用のダイナミクスを-innate。粘膜感染モデルの限られた数は、すべての消化管障害/感染24,43に限定されるものではゼブラフィッシュにおいて記載されている。ここに提示浮袋モデルが肺にいくつかの類似点を共有し、閉じ込められたサイトを提供しています臓器に感染部位を拡張洗い流されるべき病原体にはあまり可能性と、感染の。 これらの技術を習得する際に考慮しなければならないいくつかの重要な要因がある。最も重要な点は、膨張した浮袋の要件です。これは28℃または33℃で4 DPFで飼育時5 DPF歳のことを魚が必要ですこのより高い温度は、魚の開発を加速し、より良い哺乳類上皮温度（マウス皮膚温度は33.1℃で 44である）の生理学的範囲を近似するために使用される。しかし、この特定の温度範囲で、このモデルの制限に留意する必要があると観察された表現型は、より完全な解釈のために哺乳動物系で確認されるべきである。空気圧ダクトphysostomous魚類（ゼブラフィッシュを含む）と高圧injのに開いたままで注射部位（後部浮袋）も重要である浮袋を過ぎや消化管に病原体をプッシュすることができ、臓器の別の場所でection。トランクの魚の厚みが困難浮袋の両側を可視化することを可能にするため、酵母細胞は、浮袋の背面にすべてでない場合には接種材料の定量もあまり正確である。浮袋の切開は、器用さを必要とし、画像化に起因手順の物理的外傷にアーチファクトを回避するために直後に行われる必要がある。 技術の限界は、魚の発達段階に主に関連している。これは、研究の数日モルホリノ技術の使用を制限し、ノックダウン効果は、慎重に完全または部分的な有効性を区別するために試験されなければならない。モルホリノ活動は開発中のこの後半は、以前に報告されている、と我々はまた、成功してまだ5 DPFに有効であった検証スプライスブロッキングで、このモデルではモルフォリノを使用してきた。 PHARMの使用魚の年齢に制限はありませんようにacological薬は、この特定のモデルでは良い代替手段かもしれません。 72時間後に受精過去の魚を使用することは時々、幼虫のゼブラフィッシュでの作業の機関の動物の管理と使用の委員会に応じてより多くの監督が必要です。ゼブラフィッシュは、静的な実験室条件45で10日間以上の高レートで生存しないように、研究の長さも、拘束されている。一方で、代わりに若い胚または幼虫の開発DPF 5の稚魚を使用するような腎臓、肝臓や膵臓などのすべての器官が46-49完全に機能的研究が可能になります。 インビトロ細胞培養またはインビボでのマウスモデルにおいて比較し、（抗体および化学的ア ​​ンタゴニスト、アゴニスト）の試薬 ​​の数はゼブラフィッシュにおいて制限されている。しかし、メディアに直接化学物質を追加する可能性が有利である。ノックアウトの数とノックインゼブラフィッシュはまだ限られているが、RISターゲットゲノム編集のeは、変異体の生成のための刺激的な可能性を開く。若年ゼブラフィッシュの透明性蛍光レポーター系（細胞型特異的またはシグナル伝達経路特異的）を構築するための相対的な容易さの組み合わせは、このシステムの主とユニークな利点の一つである。 楽しみにしているゼブラフィッシュ浮袋感染モデルは、上皮を通じて侵入する他の病原体のための感染症の新たなルートを提供し、脊椎動物の疾患をプロービングするためのこの器官の有用性を強調し、脊椎動物の粘膜上皮における宿主 - 病原体相互作用について尋ねことができる質問の範囲を拡張。 粘膜レベルでの上皮感染のゼブラフィッシュのモデルは、薬や病原体24,43によって腸管障害の影響を探ることが発表されている。しかし、この粘膜カンジダ症モデルがswimbを利用することが第一です。はしごため、消化管を超えてゼブラフィッシュで調べることができる感染部位の範囲を拡張します。浮袋の粘膜表面および哺乳動物肺の違いは完全には解明されておらず、高等脊椎動物に、このモデルからのデータの解釈/翻訳を注意深くなされるべきである。 浮袋感染は、脊椎動物感染モデルにおける現在のギャップを埋め、病原体に先天性免疫/上皮細胞の相互作用を画像化するためのウィンドウを開きます。今、以前に立ち入り禁止の質問の多様な範囲は、探索することが実現可能である。我々は、互いに、そして上皮細胞、それらの時空間動員、およびC.の性質の異なる自然免疫細胞の相互作用を決定することができるアルビカンスの増殖および非免疫抑制宿主における免疫攻撃および疾患の進行に関連する形態学的切替。画像への可能性は、GREの日数に数時間そのままホスト詳細にこのシステムの明らかと大きな利点を表している。 最後に、浮袋と哺乳類の肺の間に存在論的、および遺伝子発現の類似性は、さらに遺伝子ノックダウンや化学薬品でこの器官を標的にする微生物の肺相互作用および免疫学50〜52の保存されたメカニズムを明らかにすることができることを示唆している。

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml tubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Deep Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Wooden dowels</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 injection system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td><td></td></tr><tr><td>20X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Roller drum</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Children clay (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A immersion oil</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fishing wire</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well imaging plate (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Microslide (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (EMD chemicals)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-well culture dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Weight boats (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

粘膜病原体に対する初期の防衛は上皮バリアと自然免疫細胞の両方で構成されています。両方の免疫適格、と彼らの相互通信は、感染症に対する保護のための最も重要である。病原体上皮および自然免疫細胞の相互作用は最高の複雑な挙動は、時間と空間に繰り広げられる、生体内 、 で調査されている。しかし、既存のモデルは、粘膜レベルでの病原体との戦いの容易な時空間的イメージングを可能にしない。 ここで開発されたモデルは、少年ゼブラフィッシュの浮袋に、真菌病原体、 カンジダ·アルビカンスの直接注射により粘膜感染が作成されます。得られた感染は、上皮および粘膜疾患の発生を通じて自然免疫細胞の挙動の高分解能イメージングを可能にする。この方法の汎用性は、pHをもたらす免疫イベントの詳細なシーケンスをプローブするホストの尋問が可能にagocyte動員および保護において、特定の細胞タイプおよび分子経路の役割を検討する。また、免疫攻撃の関数としての病原体の挙動は、蛍光タンパク質を発現するC.で同時に撮像することができるアルビカンス 。宿主 - 病原体相互作用の増大した空間分解能について迅速浮袋切開技術を用いても可能である。 ここで説明粘膜感染モデルは、粘膜カンジダ症の研究のための貴重なツール作り、簡単な再現性の高いです。このシステムはまた、マイコバクテリア、正常上皮表面を介して感染する細菌またはウイルス、微生物などの他の粘膜病原体に広く翻訳可能であってもよい。

後部浮袋でマイクロインジェクションここに提示された実験方法はC.一貫した用量の注射を記載ゼブラフィッシュのDPF 4の浮袋でアルビカンス酵母細胞。イマージョンモデルと以前の研究は、Cに浮袋免疫応答を示唆しているアルビカンスは、哺乳類の粘膜カンジダ症32と同様である。ここでは、より多くの、簡単な再現性があり、迅速であり、変更された感染法を実証する。ゼブラフィッシュの数百を注入し、数時間以内にスクリーニングすることができる。 浮袋の正確で再現性の感染は、マイクロインジェクションによって臓器の後部領域を標的にすることによって達成される。浮袋への注射は、幼虫または胚ゼブラフィッシュ（ 例えば、静脈内または後脳心室）のために、他のほとんどのマイクロインジェクションルートよりも学ぶことは簡単です。注射の前に魚の準備がシミです浮袋は魚が古いように膨張される必要があることを除いて、他の注入部位の場合とLAR、。 33℃での養殖魚の約75％が4のdpfによって膨張した浮袋を有した（データは示さず）。浮袋は魚を注入するために使用される表皮ならびに薄い筋肉層およびマイクロニードルの下に配置される面取りされる必要がある。魚が注入される角度（ 図3A）は、大幅に手順の速度および容易さを改善する。それはすべてのスクリーニング酵母細胞の可視化を可能にし、選択範囲をスキューう浮袋の各側の酵母細胞の存在を回避するように浮袋の背面にボーラスの注入が重要である。浮袋の背面に向かって注入することも空気圧ダクトを通った後、消化管の下接種材料の損失の可能性を避けることができます。ボーラスが気泡と変位として魚が注入された検証は比較的容易であるバック浮袋のは、その後のメディア（ 図3C）が充填されている。これは、注入時の可視化を容易にするであろう、フェノールレッドを使用することも可能である。なぜならCの大きさのアルビカンス酵母細胞（3 -が4μm）、接種量は、マイクロニードルの閉塞に起因する5×10 7のcfu / mlのより低い濃度に制限される。これは、5 nlのボーラス内に、1〜250の酵母細胞の注入を可能にする。私たちの手では、1〜1.5×10 7 CFU / mlで4 NLを注入するには、最も一貫性のある結果が得られた。これは、魚1匹あたり10〜50酵母細胞の範囲をもたらした。 15-25酵母細胞（ 図3B）に接種材料を狭めることより厳しい表現型とレスポンスを提供します。これらの条件を用いて、注入された魚の約50％が、95％を超える生存率24時間後噴射に適切な接種範囲（データは示さず）を有している。これは、上の病原体負荷の影響を調査するために、より低い/より高い接種物魚を維持することも可能である病気の発症。 浮袋は（楕円体の体積の計算式を使用して400×200×200ミクロン、長さx H x幅）約100 nlの総容量であるため、高いボリュームの注入も可能です（4 NLの3パルスまでされている魚の生存率に有意な影響なしに使用し、データは示さず）。 ホストと病原体の動作の両方を追跡する個々の魚の長手方向の生体内イメージング宿主および病原体の両方の動作は、このモデルを使用して、数日間の非侵襲的追跡することができる。画像化する能力、インビボでの高解像度での感染の開発は、粘膜カンジダ症の発症機序を調べるために使用されていることができる。好中球は、マウスおよびヒト35-38におけるカンジダ症への抵抗で重要な役割を果たしている。使用MPO：GFPゼブラフィッシュ39（好中球は、緑色蛍光タンパク質を発現する）、及びC. dTomを表現アルビカンス赤色蛍光タンパク質32 ATO、我々は、感染の初期（ 図4）の間に好中球カンジダダイナミクスを観察した。 好中球は、粘膜感染部位に動員された最初の生得的な細胞型である、ライブC.と浮袋の感染アルビカンスは、好中球（ 図4A、B）の迅速かつ連続的な動員につながる。熱で殺した酵母細胞は、（ 図4A、B）を注入した際に興味深いことに、好中球は、実質的に浮袋に動員されていません。 フィラメントは、酵母細胞の注入後に急速に発展し、C.アルビカンスは最初の48時間のポスト噴射（HPI）のために発芽し続けています。しかし、フィラメントの数が減少する。この時点（ 図4D）および酵母の割合が増加した後（図示せず）。非侵襲的に個々の魚を追跡する能力は、これらの縦の研究（24ウェルプレートを可能に組織培養皿）とは、疾患の進行および宿主応答（ 図4C）の個人差を強調する。数日間感染部位で真菌および免疫細胞を列挙するような詳細な研究は、マウスにおいて非実用的で残る。 急速浮袋解剖技術は、イメージングを向上させるため C.による免疫細胞または上皮細胞の相互作用を撮像するアルビカンスは、ここに提示モデルで比較的容易である。しかし、特定の状況では、気泡の存在浮袋、皮膚と筋肉を取り囲む組織の厚さは、詳細な空間分解能を損なう。画像品質を改善するために、我々は、共焦点顕微鏡（ 図5A）により（10分以内）に急速ゼブラフィッシュ画像の外に浮袋を分析するための方法を開発した。蛍光は、遍在的に発現されるトランスジェニックフィッシュ系統を撮像する場合に特に有用であるGFP 40またはαカテニン：シ ​​トリンライン41,42（ 図5B、C）、およびそのようなNF-κBなどの周囲の組織内の余分な蛍光は、あります。技術は急速に実行するように器用さと練習が必要ですが、それはすべての魚の95％が試みられ、完全に画像に実現可能である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig1highres.jpg" /> 図1：浮袋を注入するためのマイクロニードル形状。 （A）マイクロニードルの形状と測定の概要A.から微小針の先端の（B）倍率Bのそれぞれの主要な垂直線が離れて0.2ミリメートルである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig2highres.jpg" /> 図2：イメージングスライド 。 2％のLMA降下がスライドガラスに約1cm離して真空グリースの4ドットの中央に配置されている。ディッセCTED浮袋は、LMAの中央に配置され、それがLMAと真空グリースに接触するまで、カバースリップ上に下げられる。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig3highres.jpg" /> 図3：浮袋中のC. albicansの注射は、注射部位に局在まま。落射蛍光顕微鏡法による15~25酵母細胞の注入ボーラスのための選択後（A）ゼブラフィッシュの幼生のdpf 4浮袋の背面にC.アルビカンスを注入するマイクロニードルの向きおよび位置の概略図、（B）の代表的な接種材料魚の3つの異なるグループのため。 C.のnはグループA、B、およびCはそれぞれ17、17、及び20（C）代表的な画像を、平均および平均の標準誤差で表される。すぐに麟蹄後にAB少年ゼブラフィッシュにおけるアルビカンス （CAF 2-dTom、カンジダを表す赤色蛍光）感染ction。画像は、（それぞれ左および右パネル）10Xと20Xの目的で取得した（それぞれ12及び19スライス）赤チャネルにおける最大突出部の複合体であるDICチャンネルにおける単一のスライスとした。気泡（黄色）と上皮ライニング（白）の概要は、左側のパネル上に表示されている。スケールバーはそれぞれ、250と50程度を表す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig4highres.jpg" /> 図4：浮袋注入は、ホスト病原体ダイナミクスの時空間的切開を可能にする。 （A）MPOの代表的な画像：4 DPFで浮袋にライブまたは熱殺した（HK）のCaF2-dTomを注射し、GFPの魚のラインは48 HPIをイメージした。画像は、緑のAの最大値投影の複合体であるND赤チャネル（20スライス）とDICチャンネルにおける単一のスライス。スケールバーは、100μmを表す。（B、C）。 C.への応答をホストアルビカンス感染症。好中球は、早ければ6 HPIとして感染症（SOI）の部位に補充し、48時間かけて増え続けるされている。画像への可能性と（24ウェルプレート）を分離し、個々の魚を保つには、詳細な免疫動態を可視化されることを可能にする。（D）病原体応答℃にアルビカンス酵母細胞は、最初の24 HPIのために発芽するが、24 HPIから酵母細胞に戻すされている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig5highres.jpg" /> 図5：浮袋の解剖が画像化される細かい詳細が可能になります。トンの（A）概略図彼は4-5 DPFのゼブラフィッシュで浮袋の解剖に必要な手順。ブルーの矢印は、ピンセット（右用左用LとR）で引っ張っての方向を示す。（B、C）。 αカテニンから解剖浮袋の代表的な画像：シトリンの魚のライン41,42（緑のタイトジャンクション）は、カンジダ·アルビカンスと4 DPF（CAF2-dTom）で注入し、共焦点顕微鏡2 HPIによって画像化。パネルはBで100μmのパネルBにスケールバーに赤と緑のチャネル（Bの25スライスとCのために3スライス）の最大突起及びDICのための単一のスライスの複合体であるとCの100及び10μm <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig5large.jpg" target="_blank">くださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>ボリューム（NL） </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td>直径（mm） </td><td> 0.124 </td><td> 0.156 </td><td> 0.179 </td><td> 0.197 </td><td> 0.212 </td></tr></tbody></table> 表1：直径関係にボーラスボリューム。

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Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K ビュー.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

免疫・感染学

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

発生生物学

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells to inflammatory disease due to their functionally conserved innate immune system. They are also widely used to examine how innate immune cells help guide developmental processes. By taking advantage of the optical transparency and genetic tractability of larval zebrafish, these studies often focus on live imaging approaches to functionally characterize fluorescently marked macrophages and neutrophils within intact animals. Due to their diverse functional heterogeneity and ever-expanding roles in disease pathogenesis, macrophages have received significant attention. In addition to genetic manipulations, chemical interventions are now routinely used to manipulate and examine macrophage behavior in larval zebrafish. Delivery of these drugs is typically limited to passive targeting of free drug through direct immersion or microinjection. These approaches rely on the assumption that any changes to macrophage behavior are the result of a direct effect of the drug on the macrophages themselves, and not a downstream consequence of a direct effect on another cell type. Here, we present our protocols for targeting drugs specifically to larval zebrafish macrophages by microinjecting drug-loaded fluorescent liposomes. We reveal that poloxamer 188-modified drug-loaded blue fluorescent liposomes are readily taken up by macrophages, and not by neutrophils. We also provide evidence that drugs delivered in this way can impact macrophage activity in a manner consistent with the mechanism of action of the drug. This technique will be of value to researchers wanting to ensure targeting of drugs to macrophages and when drugs are too toxic to be delivered by traditional methods like immersion.

Here, we describe the synthesis of drug-loaded liposomes and their microinjection into larval zebrafish for the purpose of targeting drug delivery to macrophage-lineage cells.

薬物を含むリポソームを注射してラーバルゼブラフィッシュマクロファージに薬物を標的にする

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

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ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

使用

イメージング病因とのコーディングを解読し、

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

薬物を含むリポソームを注射してラーバルゼブラフィッシュマクロファージに薬物を標的にする

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

要約

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この動画の章

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

使用

イメージング病因とのコーディングを解読し、

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

薬物を含むリポソームを注射してラーバルゼブラフィッシュマクロファージに薬物を標的にする

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染