Name: modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

המחברים מודים לד&quot;ר Le טרין וד&quot;ר טובין לנדיבות מתן α-קטנין: קו דגי סיטרין וביל ג&#39;קמן על שאפשר לנו לעשות את הצילומים במעבדה שלו. המחברים מודים מקורות מימון המכון הלאומי לבריאות (המענקים 5P20RR016463, 8P20GM103423 וR15AI094406) ומשרד חקלאות אמריקאי (פרויקט # ME0-H-1-00517-13). כתב יד זה מתפרסם כחקלאות וראשי ניסוי יערנות מספר פרסום התחנה 3371.

הערה: כל פרוטוקולי טיפול דג הזברה והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות NIH תחת מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) A2012-11-03 פרוטוקול. 1. דג הזברה גידול עד 4 ימי הפריה הודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דג הזברה AB, או כל קווים מהונדסים אחרים, תוך שלאחר ההפריה 3 שעות הראשונות, כפי שמוצג בסרטון אחר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 120 ביצים ב-15 סנטימטרים צלחות פטרי המכילות 150 מיליליטר של תקשורת E3 (5 mM NaCl; 0.17 מ&quot;מ KCl; 0.33 מ&quot;מ CaCl 2; 0.33 מ&quot;מ MgCl 2; 2 מ&quot;מ HEPES; pH 6.8) עם מתילן הכחול (מיקרוגרם 0.3 סופי / ml ריכוז) בחממה C ° 33 עם 12/12 האור / photoperiod כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת לאחר שעה 6 עם E3 + PTU (1-פניל-2-thiourea, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) ולהסיר את הביצים מתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 ימים על 33 מעלות צלזיוס, החלפת מדיה עם E3 הטרי + PTU לאחר 2 ימים. </li></ol> 2. בjection מיקרו-מחט הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי בורוסיליקט (1.2 מ&quot;מ OD, מ&quot;מ ID 0.69) למייקרו-מחט באמצעות חולץ מחט עם ההגדרות הבאות (550 חום; 0 Pull; 130 Velocity; 110 זמן). הערה: ההגדרות תשתנה מחוט הלהט לחוט להט להשיג מיקרו-מחטים בצורה דומה (ראה איור 1) ויהיה צורך בכל פעם שסדרה את נימה חדשה מותקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט עם 3 μl של 0.4 מיקרומטר מלוח מסונן-חיץ פוספט (PBS; 137 מ&quot;מ NaCl; 2.7 מ&quot;מ KCl; 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4; 1.8 מ&quot;מ KH 2 PO 4; pH 7.4) בעזרת פיפטה microloader 20 μl טיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרו-המחט על בעל micropipette על micromanipulator המחובר למערכת הזרקה בלחץ. הגדר את לחץ ההזרקה עד 30 PSI ומשך הדופק ליום 30 באלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת פטרי עם מים מזוקקים, להוריד את מיקרו-המחט עד 1/5 של המחט הוא במים. קליפ wi מיקרו-המחטth פינצטה בסדר, ממש מתחת למפלס המים. להביא מיקרו-המחט מחוץ למים וללחוץ על הדוושה מספר פעמים עד בולוס מופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הקוטר של בולוס ידי הורדת מיקרו-המחט על hemocytometer שכבתי עם ירידה של סוג אחד שמן טבילה. התאם את משך הדופק כדי לקבל את העצמה הרצויה (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את backpressure לבולוס להישאר יציב בשמן (להוריד את הלחץ אם בולוס מגביר את עוצמת השמע ולהגדיל את backpressure אם בולוס הנפח קטן). רשום את משך הדופק לכל מיקרו-מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ממייקרו-המחט על ידי aspirating אותו באמצעות קצה פיפטה microloader ולגרש את השמאל על PBS על ידי הצבת אותו בחזרה על המזרק ומדליק את הדופק הרציף. שומר כל מיקרו-מחט. </li></ol> 3. הכנת קנדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנדידה אלביקנס Streak הפך עם אופטימיזציה קודון dTomato, GFP, BFP, EOS או רחוקאדום ממניות קפוא (-80 ° C המניה ב -25% גליצרול) באמצעות מסמרת עץ סטרילי על דקסטרוז שמרי peptine (YPD) צלחת אגר (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L , אגר L / 20 g; autoclaved ושפכתי 25 מיליליטר בצלחות פטרי) ודגירת הלילה בשעה 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת באמצעות מסמרת עץ סטרילי ולחסן 5 מיליליטר של נוזל YPD (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L, autoclaved וaliquotted סביבה נקי מחיידקים ב5 מיליליטר בתרבות זכוכית 16 x 150 מ&quot;מ צינורות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 30 ° C בתוף רולר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 1 מיליליטר של ג תרבות אלביקנס והעברה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.7 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 5000 במשך כמה שניות. רוקן את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של סטרילית PBS, מערבולת ביסודיות. חזור פעמיים זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת המושבות באמצעות hemocytometer על ידי דילול מניות 1 מיליליטר 1: 1,000 בPBS סטרילי. </li></ol> 4. הזרקת דג הזברה בSwimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם צלחת הזרקה (agarose 2%) למשך 30 דקות בחממה C ° 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 100 של 150 מיליליטר של E3 + PTU מ -15 סנטימטרים צלחת פטרי המכילה דגים להזריק בעזרת פיפטה 25 מיליליטר ללא aspirating כל דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 4 DPF דג הזברה על ידי הוספת 2 מיליליטר של 4 מ&quot;ג / מיליליטר שנאגרו tricaine מניות מתאן sulfonate (TR) לנותרה 50 מיליליטר התקשורת (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) ולהמתין במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, בחר דגים עם swimbladder מנופח. דגים גם יכולים להיות מוקרנים באותו הזמן לפנוטיפ הומוגנית, כגון הפצת נויטרופילים בMPO: קו GFP באמצעות epifluorescence לנתח מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ג מניית אלביקנס מריכוזו המקורי (שלב 3.8) 1.5 x 10 7 מושבה להרכיב יחידות למ&quot;ל (CFU / ml) בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דג הזברה על צלחת ההזרקה באמצעות צינור העברת פלסטיקטטי ולהסיר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי דיג-חוט (חוט דיג קוטר 0.012 אינץ &#39;סופר-דבוק לנימי ורוסיליקט), לעשות 3 שורות של 10 דגים, על ידי הלחיצה על צלחת ההזרקה אנכית ולהתמצא הדגים אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות מערבולת הצינור עם 1.5 x 10 7 CFU / ml ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט אחת עם 3 μl של ג אלביקנס באמצעות קצה פיפטה microloader חדש ולהגדיר את משך הדופק להגדרה המתאימה (ראה שלב 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת ההזרקה לעשות זווית של 20 מעלות בין מיקרו-המחט והראש של הדג, מכוון לכיוון חלק האחורי של swimbladder (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מיקרו-המחט לתוך swimbladder, כדי לוודא שנשאת של המחט הוא בלומן, ולחץ על הדוושה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל דגים ולהעביר לצלחת התאוששות (25 מיליליטר E3 + PTU) על ידי הצפת המנה עם E3ד לרוקן אותה לתוך צלחת ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דגים אחר לצלחת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה חוזרת עם מיקרו-מחט חדשה מלאה ביסודיות vortexed ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיום על ידי הזרקת שליטת PBS, במידת צורך, באמצעות צלחת הזרקה שונה, כדי למנוע זיהום ולהעביר לצלחת נפרדת התאוששות (שלב 4.10). </li></ol> 5. הקרנת הדגים לבידוד רצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של 0.4% נמוכים להמיס פתרון agarose (אה&quot;ע) על ידי הוספת 160 מ&quot;ג של נמוך להמיס agarose 40 מיליליטר של E3, רותח על ידי במיקרוגל עד שהיא נמסה, וקירור עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 400 μl של TR (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) מקורר פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות התאוששות, לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מ&quot;ל E3 + PTU, 200 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 30 דגים (עם תקשורת קטנה ככל האפשר) עד 2 מיליליטר של LMA בסירה במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים לשאוב בודדים עם טפטפת העברה וצלחת הדגים עם טיפות 1 של LMA לתוך צלחת הדמיה 96-היטב, רק באמצעות 10 x 6 הבארות מרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד שכל הדגים למסך נטענים לצלחת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התקשורת לגבש בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגים בצד שלהם, כדי לוודא שהם נמצאים בקשר עם תחתית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 20X על epifluorescence / מיקרוסקופ confocal הפוך והמסנן המתאים, לרשום את המספר של ג תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של כל דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הדג עם 15-25 תאי שמרים בswimbladder (או הבידוד רצוי), להרדים לא נבחרו-דגים (800 / מיליליטר מיקרוגרם של TR בE3) ולחזור דגים נבחרו לצלחת פטרי עמוקה 50 מיליליטר של E3 + PTU עם על ידי הוספת 3 טיפות של E3 לבארות שנבחרו צלחת ההדמיה וaspirating הדגים עם טפטפת העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 33 מעלות צלזיוס למשך הרצוי. </li></ol> 6. הדמיה הדגים Post-ההקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 25 של 50 מיליליטר של תקשורת E3 + PTU מהצלחת העמוקה פטרי המכילה דגים לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מיליליטר E3 + PTU שנותר, מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הדגים לצלחת 96-היטב הדמיה ומיקום הולם (שלבים 5.3-5.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על ידי סריקה מיקרוסקופית confocal באמצעות הלייזרים המתאימים ומסנני פליטה. מוקד ראשון על הדגים באמצעות מטרת 4X תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ולרכוש תמונות של האזור של עניין באמצעות מטרת 20X עם לייזרי confocal במצב סריקה עם 2 מהירות μsec / פיקסל ו1024 x 600 פיקסל יחס ממדים. לרכוש Z- ערימות עם גודל צעד מיקרומטר 1, החלת מצב מסנן קלמן של 3 מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל צלחת פטרי עמוקה עם 50 מיליליטר E3 + PTU או לindividuaבארות l (צלחת 24 גם תרבות, 3 מיליליטר E3 + PTU) ולדגור על 33 מעלות צלזיוס. </li></ol> 7. ביתור Swimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LMA 2% (שלב 5.3 עם 160 מ&quot;ג של התכה נמוכה agarose ב 8 מיליליטר של E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, לטשטש את הדגים (שלב 5.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 10 דגים לצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות עם 1 מיליליטר של E3 ולהרדים על ידי הוספת 200 μl של 4 מ&quot;ג / מיליליטר Tricaine (מיקרוגרם / מיליליטר סופי ריכוז 800) לצינור צנטריפוגות ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות זכוכית הדמיה על ידי הצבת 4 טיפות של שומן ואקום בכיכר, מלבד 1 סנטימטר על microslide (75 x 25 מ&quot;מ, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 טיפות של 2% LMA באמצע הכיכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דג אחד בשקופית זכוכית נפרדת תחת מיקרוסקופ לנתח ולוודא שהלב הפסיק מכות, להסיר את עודפי המים. </li><li&gt; שימוש בפינצטה בסדר לנתח swimbladder על ידי שמירה על הראש בתנוחה קבועה עם פינצטה השמאל ומושך את הבטן הקדמית עם פינצטה תקין (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את swimbladder על ידי צינור פנאומטי עם פינצטה השמאל, מפריד אותה ממערכת העיכול, ולמקם אותו במרכזה של LMA 2% לפני שהוא מבצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כיסוי להחליק (18 x 18 מ&quot;מ) על גבי שקופית זכוכית הדמיה ולדחוף אותו עד שהוא נוגע גריז הוואקום, כמו גם את אה&quot;ע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בתוך 10 דקות של נתיחה כמתואר בשלב 6.4. חזור על שלב 7.7-7.11 עם הדגים האחרים. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התקדמות ומגבלות מודל המחלה microinjection swimbladder המודל שהוצג כאן הוא הרחבה של מודל טבילת פטרת הרירי המתואר בGratacap et al (2013).; זה מוסיף את היתרונות של זמן זיהום בשליטה, במינון מאוד לשחזור זיהום, ושיפור יעילות ולכן. אנו מדגימים כאן שיטות חדשות המאפשרות תיעוד לא פולשנית זמני של דינמיקת זיהום בפירוט רב, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר vivo לשעבר של swimbladder. נהלים אלה צריכים להקל על המחקר של ג אלביקנס -innate דינמיקת אינטראקציה מערכת חיסונית ברירית. מספר מצומצם של דגמי זיהום ברירית תוארו בדג הזברה, כל מוגבל להפרעה / זיהומים בדרכי עיכול 24,43. מודל swimbladder מוצג כאן מרחיב את האתרים של זיהום לאיבר שמחולק כמה קווי דמיון לריאות ומציע אתר מוגבלשל זיהום, עם פחות אפשרות לפתוגן שנשטף. ישנם מספר גורמים קריטיים שחייבות להילקח בחשבון בעת ​​השליטה בטכניקות אלה. הנקודה החשובה ביותר היא הדרישה לswimbladder מנופח. זה מחייב את הדגים לגילי 5 DPF כאשר גודלו על 28 מעלות צלזיוס או 4 DPF על 33 מעלות צלסיוס טמפרטורה גבוהה זו משמשת כדי להאיץ את הפיתוח של הדגים וטובים יותר להתקרב לטווח הפיזיולוגי של טמפרטורות אפיתל יונקים (טמפרטורת עור עכבר היא 33.1 מעלות צלזיוס 44). עם זאת, ההגבלה של מודל זה לטווח טמפרטורה מסוים זה צריך להיות כל הזמן בראש ופנוטיפים שנצפו צריכים להיות מאומתים במערכת יונקים לפרשנות מלאה יותר. אתר ההזרקה (swimbladder האחורי) הוא גם קריטי, כמו הצינור פנאומטי נשאר פתוח בדגי physostomous (הכולל דג הזברה) וinj בלחץ גבוהection במקומות אחר באיבר יכול לדחוף את הפתוגן העבר swimbladder ולמערכת העיכול. כימות של הבידוד היא גם מדויקת פחות, אם תאי השמרים הם לא כל בחלק האחורי של swimbladder, כי העובי של הדגים בתא המטען עושה את זה קשה לדמיין את שני הצדדים של swimbladder. Dissection של swimbladder דורש מיומנות והדמיה צריכה לקחת מקום מייד לאחר להימנע חפצים בשל הטראומה הפיסית של ההליך. המגבלות של הטכניקה הן בעיקר קשורות לשלב ההתפתחותי של הדגים. זה מגביל את השימוש בטכנולוגית morpholino לכמה ימים של מחקר, ויעילות מציאה יש להיבדק בקפידה כדי להפלות בין יעילות מלאה או חלקית. Morpholino פעילות זו בשלב מאוחר בהתפתחות כבר דווח בעבר, וגם השתמשנו בהצלחה morpholinos במודל זה, עם תוקף אחוי חסימה שעדיין הייתה יעיל ב 5 DPF. השימוש בפארםתרופות acological עשויות להיות חלופה טובה בדגם מיוחד זה שכן אין הגבלה לגיל של הדג. השימוש בדגי העבר 72 שעות לאחר ההפריה לפעמים דורש יותר פיקוח מאשר לעבוד עם דג הזברה זחל, בהתאם לועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים. אורכו של המחקר הוא גם מוגבל, כדג זברה אינה שורד בשיעורים גבוהים יותר מ- 10 ימים בתנאי מעבדה סטטי 45. מצד השני, שימוש בדגים לנוער של 5 DPF פיתוח במקום עוברים או זחלים צעירים מאפשר ללימודים שבו כל האיברים כמו כליות, כבד או לבלב הם פונקציונליים 46-49 באופן מלא. בהשוואה לתרבות תאים במבחנה או במודלים עכבריים vivo, המספר של חומרים כימיים זמינים (נוגדנים ואת יריבים-אגוניסטים כימיים) מוגבל בדג הזברה; עם זאת, האפשרות להוסיף כימיקלים ישירות לתקשורת היא יתרון. מספר נוקאאוט ודג הזברה לדפוק בהוא עדיין מוגבל אך RISדואר של עריכת הגנום ממוקדת פותח אפשרויות מרגשות עבור הדור של מוטציות. השילוב של הקלות יחסית לבניית קווי כתב ניאון (סוג תא מסוים או מסלול איתות ספציפי) עם השקיפות של דג הזברה לנוער נשאר אחד היתרונות העיקריים וייחודיים של מערכת זו. במבט קדימה מודל זיהום swimbladder דג הזברה מרחיב את הטווח של שאלות שיכולים להישאל על אינטראקציה מארח הפתוגן באפיתל הרירי חוליות, המציע מסלול חדש של זיהום לפתוגנים אחרים שלפלוש דרך האפיתל ומדגיש את התועלת של איבר זה לחיטוט מחלה חוליות . מודלים דג הזברה של זיהום אפיתל ברמה הרירית פורסמו כי לחקור את ההשפעות של הפרעת מעיים על ידי תרופות או פתוגן 24,43. עם זאת, מודל פטרת רירית זו הוא ראשון לנצל את swimbסולם וכך מרחיב את הטווח של אתרים של זיהום שיכול להיחקר בדג הזברה מעבר למערכת העיכול. הבדלים בין המשטח הרירי swimbladder והריאות של יונקים לא הובהרו במלואו ופרשנות / תרגום של נתונים ממודל זה לחוליות גבוהות יותר צריך להיעשות בזהירות. זיהום swimbladder ממלא פער נוכחי בדגמי זיהום חוליות ופותח חלון להדמית האינטראקציות של תאי אפיתל / חיסון מולדים עם הפתוגן. עכשיו מגוון רחב של שאלות, בעבר מחוץ לתחום, אינו ריאלי לחקור. אנחנו יכולים לקבוע את יחסי הגומלין של תאים חיסוניים מולדת שונים אחד עם השני ועם תאי אפיתל, גיוס מרחב ובזמן שלהם, ואת האופי של ג התפשטות אלביקנס ומיתוג מורפולוגיים ביחס להתקפה חיסונית והתקדמות מחלה במארח שאינה immunosuppressed. האפשרות לתמונת מארח שלם במשך כמה שעות עד ימים בGREבפירוט מייצג יתרון ברור וגדול של מערכת זו. לבסוף, דמיון הביטוי אונטולוגית וגנים בין swimbladder והריאות של היונקים מציע עוד כי מיקוד איבר זה במציאת גן או תרופות כימיות עלול לחשוף את המנגנונים שמורים של אינטראקציה של חיידקים-ריאה ואימונולוגיה 50-52.

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml tubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Deep Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Wooden dowels</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 injection system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td><td></td></tr><tr><td>20X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Roller drum</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Children clay (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A immersion oil</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fishing wire</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well imaging plate (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Microslide (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (EMD chemicals)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-well culture dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Weight boats (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

הגנה מוקדמת מפני פתוגנים רירית מורכבת משני מחסום האפיתל ותאי חיסון מולדים. Immunocompetency של שניהם, ואינטרקום, הם בעל חשיבות עליונה להגנה מפני זיהומים. האינטראקציות של תאי מערכת חיסון המולדים אפיתל ועם הפתוגן נחקרות הטובות ביותר in vivo, שבו התנהגות מורכבת נפרש על פני זמן ובמרחב. עם זאת, מודלים קיימים אינם מאפשרים הדמיה מרחב ובזמן קלה של הקרב עם פתוגנים ברמה הרירית. המודל שפותח כאן יוצר זיהום ברירית על ידי הזרקה ישירה של הפתוגן פטרייתי, קנדידה אלביקנס, לswimbladder של דג הזברה לנוער. הזיהום כתוצאה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אפיתל והמולד התנהגות תא חיסונית לאורך התפתחות מחלת רירית. הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת לחקירה של המארח כדי לחקור את הרצף המפורט של אירועים חיסוניים המובילים לphגיוס agocyte ולבחון את תפקידם של סוגי תאים מסוימים ומסלולים מולקולריים בהגנה. בנוסף, ההתנהגות של הפתוגן כפונקציה של התקפה חיסונית ניתן הדמיה בו זמנית על ידי שימוש בג-להביע חלבון פלואורסצנטי אלביקנס. רזולוציה מרחבית מוגברת של האינטראקציה מארח הפתוגן ניתן גם להשתמש בטכניקה לנתיחה swimbladder המהירה תיארה. מודל הזיהום ברירית שתואר כאן הוא פשוט ושחזור מאוד, מה שהופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פטרת ברירית. מערכת זו יכולה להיות גם באופן רחב הניתנות לתרגום לפתוגנים ריריים אחרים כגון חיידקים mycobacterial, חיידקים או ויראלי, כי בדרך כלל להדביק באמצעות משטחי אפיתל.

Microinjection בswimbladder האחורי השיטה הניסיונית שהוצגה כאן מתארת ​​את ההזרקה של מינון של ג עקבי תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של 4 DPF דג הזברה. עבודה קודמת עם מודל הטבילה עולה כי התגובה החיסונית swimbladder לג אלביקנס דומה לפטרת ברירית יונקים 32. כאן אנו מדגימים שיטת זיהום שונה שהיא יותר פשוט, לשחזור ומהיר; כמה מאות דג הזברה יכולות להיות מוזרקים והוקרנו בתוך כמה שעות. זיהום מדויק ושחזור של swimbladder מושגת על ידי מיקוד באזור האחורי של האיבר על ידי microinjection. ההזרקה לswimbladder קלה יותר ללמוד מאשר רוב מסלולי microinjection האחרים לדג הזברה זחל או עוברי (למשל חדר, תוך ורידי או למוח האחורי). ההכנה של הדג לפני הזריקה היא סימיlar לזה של אתרי הזרקה אחרים, עם החריג שswimbladder צריך להיות מנופח, כדי שהדג מבוגר יותר. כ -75% מהדגים שהועלו על 33 ° C יש לי swimbladder מנופח על ידי 4 DPF (מידע לא מוצג). Swimbladder נמצא מתחת אפידרמיס, כמו גם שכבת שריר דקה ומייקרו-המחט המשמש להזרקת הדגים צריכה להיות משופע. הזווית שבה הדגים מוזרקים (איור 3 א) גם משפרת באופן משמעותי את המהירות והקלות של ההליך. הזרקה של בולוס בחלק האחורי של swimbladder חשובה כמו זה מאפשר הדמיה של כל תאי השמרים כאשר המיון וימנע את הנוכחות של תאי שמרים בכל צד של swimbladder, אשר להטות את טווח הבחירה. הזרקה לכיוון חלק האחורי של swimbladder גם תמנע אובדן אפשרי של הבידוד דרך צינור פנאומטי ולאחר מכן את מערכת העיכול. אימות שדגים כבר הזריק קלה יחסית כמו בולוס מחליף את הבועה והאווירגב swimbladder מלא לאחר מכן עם תקשורת (איור 3 ג). אפשר גם להשתמש בפנול אדום כאשר הזרקה, אשר יהפוך את ההדמיה קלה יותר. בגלל הגודל של ג תאי שמרי אלביקנס (3 - 4 מיקרומטר), מנת הבידוד מוגבלת לריכוזים נמוכים 5 x 10 7 CFU / ml כתוצאה מסתימת מיקרו-המחט. זה מאפשר ההזרקה של בין אחד ו -250 תאי שמרים בתוך 5 בולוס nl. בידיים שלנו, הזרקת 4 nl ב1-1.5 x 10 7 CFU / ml נתן תוצאות עקביות ביותר. זה הביא מגוון של 10-50 תאי שמרים לדגים. צמצום הבידוד לתאי שמרים 15-25 (איור 3) נותן פנוטיפ ותגובה חזק יותר. שימוש בתנאים אלה, יש לי כ -50% מהדגים שהוחדרו מגוון הבידוד המתאים עם מעל 95% הישרדות לאחר 24 שעות הזרקה (מידע לא מוצג). אפשר גם לשמור על דגים עם הבידוד נמוך / גבוה יותר על מנת לחקור את ההשפעה של נטל הפתוגן בהתפתחות מחלה. Swimbladder הוא כ 100 נפח כולל NL (400 x 200 x 200 מיקרומטר, W x H x L, באמצעות הנוסחא עבור הנפח של אליפסואיד) כך ההזרקה של כמויות גבוהות יותר הוא גם אפשרי (עד 3 פולסים של 4 nl היה שימוש ללא כל השפעה משמעותית על ההישרדות של הדגים; מידע לא מוצג). ההדמיה intravital אורך של דגים בודדים לעקוב גם מארח והפתוגן התנהגות ההתנהגות של שניהם מארח והפתוגן ניתן בעקבות הלא פולשני במשך כמה ימים באמצעות מודל זה. יכולת תמונת הפיתוח של הזיהום ברזולוציה גבוהה in vivo יכולה ונעשתה שימוש כדי לבחון את הפתוגנזה של פטרת ברירית. נויטרופילים לשחק תפקיד מפתח בהתנגדות לפטרת בעכברים ובבני אדם 35-38. MPO שימוש: דג הזברה GFP 39 (נויטרופילים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו- C. אלביקנס להביע dTomATO חלבון ניאון אדום 32, שראינו דינמיקת קנדידה neutrophil- במהלך הזיהום מוקדם (איור 4). נויטרופילים הם הסוג הראשון מולדת התא שיגויס לאתר של זיהום ברירית, והזיהום של swimbladder עם ג החי אלביקנס מוביל לגיוס מהיר ומתמשך של נויטרופילים (איור 4 א &#39;, ב&#39;). מעניין, נויטרופילים לא יגויסו באופן משמעותי לswimbladder כאשר תאי שמרים-נהרג חום הוזרקו (איור 4 א &#39;, ב&#39;). חוטים לפתח במהירות לאחר ההזרקה של תאי שמרים וג אלביקנס ממשיך לנבוט לתפקיד הזריקה הראשונה 48 שעות (HPI). עם זאת, לאחר שלב זה מספר החוטים יורד (איור 4D) וחלקם של שמרי עליות (לא מוצג). (צלחת 24 גם היכולת לעקוב אחר דגים בודדים הלא פולשני מאפשרים מחקרים ארוכי טווח אלהמנות בתרבית רקמה) ומדגישה את ההבדלים בין-האישיים בהתקדמות מחלה ותגובות מארח (איור 4C). בחינה מדוקדקת כזו, ספירת תאי פטרייה וחיסוניים באתר של זיהום על פני כמה ימים להישאר מעשית בעכבר. טכניקה לנתיחה swimbladder מהירה כדי לשפר את ההדמיה הדמיה האינטראקציה של תאי מערכת חיסון או אפיתל עם ג אלביקנס הוא קל יחסית במודל שהוצג כאן. עם זאת, בנסיבות מסוימות, הנוכחות של בועת האוויר ואת העובי של הרקמה הסובבת swimbladder, העור ושרירים, פוגעים ברזולוציה מרחבית מפורטת. כדי לשפר את איכות תמונה שפיתחנו שיטה לנתח את swimbladder מתוך דג הזברה ותמונתו במהירות (תוך 10 דקות) על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 5 א). התכונה זו שימושית במיוחד כאשר הדמיה קווי דג מהונדסים שבו באו לידי ביטוי בכל מקום הקרינהויש הקרינה מיותרת ברקמה הסובבת, כגון NF-κB: GFP 40 או α-קטנין: קווי 41,42 סיטרין (איור 5 ב, ג). הטכניקה דורשת מיומנות ותרגול כדי לבצע במהירות, אבל זה אפשרי לחלוטין תמונה 95% מכל הדגים ניסו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig1highres.jpg" /> איור 1: צורת מיקרו-מחט להזרקת swimbladder. סקירה כללית (א) לצורת מיקרו-המחט והמדידה. הגדלה (B) של קצה מיקרו-מחט מא כל קו אנכי המרכזי בB הוא 0.2 מ&quot;מ זה מזה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig2highres.jpg" /> איור 2: הדמיה שקופיות. ירידת LMA 2% ממוקמת באמצע 4 נקודות של שומן ואקום, מלבד 1 סנטימטר בשקופית זכוכית. Disseswimbladder cted ממוקם באמצע LMA ולהחליק את מכסה הוא הוריד בראש עד שהוא יוצר קשר עם LMA וגריז הוואקום. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig3highres.jpg" /> איור 3: הזרקה של אלביקנס ג בswimbladder נשאר מקומי לאתר של הזרקה. () סכמטי של ההתמצאות ומיקום של מיקרו-המחט להזריק אלביקנס ג לחלק האחורי של swimbladder ב 4 DPF זחלי דג הזברה. הבידוד נציג לאחר הבחירה לבולוס הזרקה של תאי שמרים 15-25 על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (B) במשך 3 קבוצות שונות של דגים. אומר וסטיית התקן של הממוצע מיוצג, n = 17, 17, ו -20 לקבוצות A, B, ו- C, בהתאמה. (ג) נציג תמונות של ג אלביקנס (CaF2-dTom, הקרינה אדומה מביעה קנדידה) זיהום בדג זברה לנוער AB מייד לאחר Injection. תמונות נרכשו עם 10X 20X ויעדים (פנלי ימין ועל שמאל, בהתאמה), והם מרוכבים של תחזיות המרביות במסלול האדום (12 ו -19 פרוסות, בהתאמה) עם פרוסה אחת בערוץ דסק&quot;ש. קווי המתאר של בועות האוויר (הצהוב) ואפיתל קרונית (לבן) מיוצגים בפנל השמאלי. ברים סולם מייצגים 250 ו 50 מיקרומטר, בהתאמה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig4highres.jpg" /> איור 4: הזרקת Swimbladder מאפשרת לנתיחה מרחב ובזמן של דינמיקת הפתוגן המארח. (א) נציג תמונות של MPO: קו דגי GFP מוזרקים עם נהרג (HK) CaF2-dTom חי או חום בswimbladder ב 4 DPF וצלמו 48 HPI. תמונות הן מרוכבים של הקרנה מקסימלי בירוקערוצי nd אדומים (20 פרוסות) ופרוסה אחת בערוץ דסק&quot;ש. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. (B, C). לארח תגובה לג זיהום אלביקנס. נויטרופילים מגויסים לאתר של זיהום (SOI) כבר בגיל 6 HPI ולשמור על הגדלת במספר מעל 48 שעות. האפשרות לתמונה ולשמור דגים בודדים המופרדים (24 גם צלחת) מאפשרת לדינמיקה חיסונית מפורטת להיות דמיין. תגובה (D) פתוגן. ג תאי שמרי אלביקנס הם נובטים לHPI 24 הראשון אבל יחזרו לתאי שמרים מ -24 HPI. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52182/52182fig5highres.jpg" /> איור 5: Dissection של swimbladder מאפשר לפרטים עדינים להיות צילמו. (א) ייצוג סכמטי של tהוא דורך מעורב בנתיחה של swimbladder בדג הזברה 4-5 DPF. חיצים כחולים מצביעים על הכיוון של משיכת עם פינצטה (L לשמאל וR לימין). (B, C). נציג תמונות של swimbladder גזור מα-קטנין: קו סיטרין דגים 41,42 (צמתים הדוקים ירוקים) מוזרקים בDPF 4 עם אלביקנס ג (CaF2-dTom) וצלמו על ידי מיקרוסקופ 2 HPI confocal. פנלים הם מרוכבים של תחזיות המרביות בערוצים האדומים וירוקים (25 פרוסות לB ו -3 פרוסות לC) ופרוסה אחת לדסק&quot;ש בברים בקנה מידת B. פנל 100 מיקרומטר בB ו- 100 מיקרומטר ו -10 מיקרומטר ג <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52182/52182fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נפח (NL) </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> קוטר (מ&quot;מ) </td><td> 0.124 </td><td> 0.156 </td><td> .179 </td><td> 0.197 </td><td> 0.212 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: בולוס נפח למערכת יחסים בקוטר.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Video: Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Developmental Biology

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells to inflammatory disease due to their functionally conserved innate immune system. They are also widely used to examine how innate immune cells help guide developmental processes. By taking advantage of the optical transparency and genetic tractability of larval zebrafish, these studies often focus on live imaging approaches to functionally characterize fluorescently marked macrophages and neutrophils within intact animals. Due to their diverse functional heterogeneity and ever-expanding roles in disease pathogenesis, macrophages have received significant attention. In addition to genetic manipulations, chemical interventions are now routinely used to manipulate and examine macrophage behavior in larval zebrafish. Delivery of these drugs is typically limited to passive targeting of free drug through direct immersion or microinjection. These approaches rely on the assumption that any changes to macrophage behavior are the result of a direct effect of the drug on the macrophages themselves, and not a downstream consequence of a direct effect on another cell type. Here, we present our protocols for targeting drugs specifically to larval zebrafish macrophages by microinjecting drug-loaded fluorescent liposomes. We reveal that poloxamer 188-modified drug-loaded blue fluorescent liposomes are readily taken up by macrophages, and not by neutrophils. We also provide evidence that drugs delivered in this way can impact macrophage activity in a manner consistent with the mechanism of action of the drug. This technique will be of value to researchers wanting to ensure targeting of drugs to macrophages and when drugs are too toxic to be delivered by traditional methods like immersion.

Here, we describe the synthesis of drug-loaded liposomes and their microinjection into larval zebrafish for the purpose of targeting drug delivery to macrophage-lineage cells.

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Neuroscience

A zWEDGI Technique to Visualize Fungal Pathogen-Infected Zebrafish Larvae

Source: Thrikawala, S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61165">Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
The video demonstrates a zebrafish wounding and entrapment device technique for observing fluorescently labeled fungal pathogen infection in zebrafish larvae. Initial infection attracts macrophages, and as infection persists, neutrophil recruitment progresses at the injection site.

טכניקת zWEDGI להמחשת זחלי זברה נגועים בפתוגן פטרייתי

1. Preparation of&#160;Aspergillus&#160;spores for injection

	From an&#160;Aspergillus&#160;spore suspension, calculate the volume needed to obtain 1 x ...