Name: the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits
Uploaded: 2014-08-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
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recCD47 1.変更高分子表面注：プロトコルは、図1に概略的に要約されているが、 図1Aは、チオール反応性ポリマー表面の生成を示す図1Bは、チオール反応性recCD47の生成を示す。 <ol><li> 1日目<ol><li>滅菌水中PDT-BzPhの溶液（1 mg / ml）で、および重炭酸カリウム（KHCO 3）（0.7 mg / mlで）を調製。 4℃（ 光から保護する ）で一晩撹拌する。 </li></ol></li><li> 2日目<ol><li> （回転車輪の周りにフィットするのに十分な長）長さ40cmの片に、ポリマーチューブをカットします。 </li><li>シェーカー上またはチャンドラーループ装置上で室温で90分間hexacylpyridiniumの0.1％水溶液中でチューブを浸す。 90分浸した後、滅菌水で3回でチューブを洗浄します。 </li><li> （15％水性リン酸二水素カリウムを添加することにより、1日目からPDT-BzPhの溶液を酸性KH 2 </suB&gt; PO 4）。曇ったミセル溶液を形成し、PDT-BzPhの1ml当たり50μlのKH 2 PO 4を追加します。 </li><li>シェーカー上又は装置上で室温で40分間、酸性化PDT-BzPh溶液中にチューブを浸す。 </li><li>一度：希酢酸（千1）で管を洗浄します。 </li><li> 60分の合計時間のための紫外線照射にチューブを公開します。チューブを回転させて¼表面領域全体を照射するために15分毎に回す。 </li><li>シェーカー上又は装置上で室温で20分間、20 mg / mlの炭酸水素カリウム（KHCO 3）の溶液中にチューブを浸す。 </li><li>滅菌水で4℃で滅菌水の3倍と店舗との管を洗浄します。 </li></ol></li><li> 3日目<ol><li> （：ドラフト内で実行します。注意 ）200μlのジメチルホルムアミド（DMF）中に5mgのスルホSMCCを溶かす。 </li><li> recCD47のポリリジン溶液をステップ1から0.1 mg / mlの中で調製スルホSMCC溶液50μlを追加し、ROで60分間攪拌オム温度。 </li><li> 60分攪拌中に、ドガはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を無菌で、取っておく。 </li><li>浄化スルホ-SMCCは、製造業者の説明書に従って7K分子量カットオフスピン脱塩カラムを使用してrecCD47を反応させた。最終的なフロースルー（高品質のチオール反応recCD47）を収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。 </li><li>無菌で2日目からのチューブを洗浄し、DPBS 3倍を脱気。 </li><li>以下で2​​分間、脱気DPBS中の20 mg / mlのとトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）の溶液をチューブの表面修飾反応する。無菌脱気DPBS 4倍で管を洗浄します。 </li><li>チューブにスルホSMCC反応recCD47を追加し、シェーカー上または装置上で4℃で一晩インキュベートする。 </li></ol></li></ol>修飾された表面上のrecCD47 0002イムノアッセイ定量<ol><li> 3日目ウィットから定量化するように変更さのチューブをすすぐ時間DPBS 3倍。店舗チューブは4℃で、DPBSで定量化のために使用されていません。 </li><li>重複チューブサンプルを作成し、96ウェルプレートのウェル中の生検パンチを配置し4mmの生検パンチを使用する。 </li><li>検出抗体で処理されていない未修正のチューブサンプルからなるネガティブコントロールを準備します。検出抗体で処理された未修正のチューブサンプルからなる抗体コントロールを準備します。検出抗体で処理された修飾されたチューブ試験サンプルを調製する。 </li><li>シェーカー上で室温で60分間、DPBS中の0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロック·サンプル。 </li><li> 、吸引BSAをブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水を加えた1％のTween-20（TBST）シェーカー上で3倍、10分ごとに洗い流してください。 </li><li>免疫アッセイのための製造業者の推奨希釈率に応じて、0.4％BSA中での抗体の使用希釈を準備します。ヒトCD47抗体B6H12-FITC 1に希釈する：0.4％BSA中100。 </li><li>適切なウェルに抗体希釈液200μlを追加します。 Incubaわずか0.4％BSAを含むTEネガティブコントロール。 （ 光から保護する ）シェーカー上で60分間室温でインキュベートする。 </li><li> TBSTで3回、シェーカー上で10分間ずつで洗い流してください。最後TBSTリンスを吸引し、チューブのサンプルウェルに200μlのDPBSを追加。 </li><li>最終的なフロースルー、高品質なチオール反応性の組換えCD47をある収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。 </li><li> FITC励起（485 nm）を発光（538 nm）の設定で、マイクロプレートリーダーを用いて、FITCシグナル強度をお読みください。 </li><li>計算recCD47は、自己蛍光および非特異的抗体対照試料からの結合を占め、標準値に基づいて、ポリマー表面に結合した。 </li></ol> 3チャンドラーループ装置プロトコル採血プロトコル前ヒト血液サンプルの収集の開始にインフォームドコンセントの書類の治験審査委員会（IRB）の承認を受けてください。情報を入手rmedヒト血液ドナーの同意。 注：装置の説明図が図2に示されている。 <ol><li>約1/2車輪が水没している直径になるまで蒸留水で水浴を埋める。 10％の漂白剤溶液を作るために、水浴に十分な漂白剤を追加します。 37℃に水浴を設定し、温度が平衡化させる。 </li><li>金属アダプタ（ 図1Bに示されている）、非修飾および修飾チューブチューブを収集し、 図1Cに示すように、装置のホイールの周りに組み立てる。チューブが所定の位置に金属製のアダプタを備えている車輪の周りにぴったりとフィットしていることを確認してください。 </li><li>クエン酸塩、または他の抗凝固剤の2ミリリットルを予め充填したバイアル中、IRBが承認したプロトコルを使用して、30ミリリットルの血液サンプルを入手し、検体が収集された後、凝固防止するために、転倒混和。 </li><li>チューブ内のいくつかの空気を残して、金属バルブとシリンジを使用して、各チューブへの血液の約10ミリリットルを追加します。バルブキャップとrを固定します3時間otate。 </li><li> 10％の漂白剤溶液で処理された廃棄物のビーカーに血液を排出（または施設の方針によって必要とされるような）。 </li><li>静かに、血液の痕跡をすべて削除するDPBSで配管内部を洗浄します。フロースルー廃棄物のビーカー内を収集します。制度的方針に基づき、血液廃棄してください。 </li><li>装置および任意の血液の10％漂白剤溶液を用いて、接触面または施設のポリシーに応じて駆除。 </li><li>蛍光顕微鏡または走査型電子顕微鏡のための処理サンプルは、下記のように。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡および細胞計数<ol><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。 </li><li> 4℃で一晩4％PFA溶液中でチューブをインキュベートする。 </li><li>一晩インキュベートした後、4％PFAを削除し、DPBSで非常に優しくフィルムをすすぐ。 </li><li>染色のために内腔面を露出するセクションにチューブをカットします。 </li><li>染み室温で30分間、4 &#39;、6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール（DAPI）でメディアを装着する数滴のチューブ部（ 光から保護 ）。染色した後、バックグラウンドDAPIシグナルを減らすためにDPBSで非常に優しくチューブをすすいでください。 </li><li> 200X倍率の下で見ると9盲目的選択されたフィールド内のセルの数をカウントするためにDAPIフィルタとデジタルカメラを装備した蛍光顕微鏡を用いた画像。 </li><li>レコードのセルは、視野当たりのカウントし、結果の統計的有意性を決定するために、適切な統計分析を行う。 </li></ol> 5。走査型電子顕微鏡<ol><li> 2％グルタルアルデヒド溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。 </li><li> 4℃で一晩、2％グルタルアルデヒド溶液中でチューブをインキュベートする。 </li><li>一晩のインキュベーションの後、静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。 </li><li>四酸化オスミウムの1％溶液を準備します（ 注意：重度吸入の危険性！ ）ドラフト内で使用してください。 </li><li>室温で15分間、四酸化オスミウムの1％溶液中でチューブをインキュベートする。 </li><li>静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。 </li><li>エタノール濃度のシリーズ（25％、50％、75％、95％、および100％エタノール）を調製。 </li><li>エタノール濃度の一連のインキュベーションによりチューブを脱水。 25％、50％、75％、20分ごとに、95％エタノール中でインキュベートする。 30分間、100％エタノール中でインキュベートする。 </li><li>臨界点は、すべての水分を除去するために45分間CO 2を有するチューブを乾燥させる。 </li><li>銀ペーストまたはグラファイトで試料スタブ上のマウントチューブセクション。 </li><li>金 - パラジウムの12.5 nmのとコートチューブセクション。 </li><li>走査型電子顕微鏡で調べます。 </li></ol>

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この刊行物で報告された研究は、ナショナルの、受賞番号T32 HL007915（JBSとRJL）の下で、受賞番号R21 EB015612（SJS）、国立心肺血液研究所の下で医学と生物工学、総合研究所によってサポートされていました保健研究所。

（ 図1に要約する）光活性化化学は、光活性化PDT-BzPhをするPDT-BzPhの付着およびそれに続くUV照射を容易にするために十分な炭化水素を有する実質的に任意のポリマー表面の改質を可能にする。反応性チオール基を有するポリマー表面を官能することは興味のある検証可能な分子の範囲のその後の取り付けを可能にします。私たちの特定の研究において、本発明者らは、組換えCD47 11-13を選びました。私たちは、使用される特定のコンジュゲーション化学は、二官能性架橋剤SMCC 11-13を有するタンパク質のアミン基との反応を含んだ。これは、チオール化ポリマー表面との反応のためのチオール反応recCD47を提供した。最終生成物は、ポリマーに共有結合recCD47モノスルフィド結合であった。 CD47中のアミノ酸のアミン基が反応に使用されていなかったことを保証する助け、それによって有効性を軽減するために、固定化されたCD47の、私たちはさらに、タンパク質のC末端にポリ - リジンタグを挿入することによりrecCD47を変更しました。これは、同様の分子戦略が他のタンパク質と適用可能であることが可能であろう。したがって、ここで提示され、他の場所11-13コンジュゲーション化学合成表面上に生体適合性を付与する可能性のある治療用分子の能力を評価するための重要な機会を提供する。 このプロトコルの欠点は、UV照射の長期間に、ポリウレタンのようなポリマーの特定の種類を露出する変色をもたらすことができることである。これはPDT-BzPhの光活性化を妨げることなく、ポリマーの変色を防止するために、（一般的に組織培養に使用される）のポリスチレン皿中にポリマーを配置することによって回避することができる。このプロトコルで使用されるUV光の波長は302 nmである。この波長からのずれがPDT-BzPhの非効率的な光活性化をもたらす可能性がある。の異なる波長を使用している場合UV光は、UV照射時間の最適化は、かなりの光活性化を確保する必要がある。 このプロトコルは、以下の免疫回避及び異物反応を防止するために、ポリマー表面に「自己」状態を伝達する目的のため、ポリマー表面にrecCD47の付着を可能にする。表面に付加recCD47の定量化は、免疫測定法、蛍光顕微鏡法（ 図3）を使用して、CD47のIgドメインにFITC標識抗体を使用して完成する。この方法は、抗体の可用性を想定してポリマー表面に付加された他のタンパク質に適合させることができる。 recCD47（または他のタンパク質）の重要な付属物を得るための障害がPDT-BzPhを光活性化に失敗し、ポリマー表面に十分な空き炭化水素、ポリマー表面の疎水性を含むさまざまな要因により、可能性、またはポリマーが厚すぎるかもしれないか光が十分なquantificのために通過することを可能にするために、不透明ation。これらの変数のすべては、実験的に試験し、特定のポリマーのために最適化することができる。 チャンドラーループ装置は、ポリマー表面へのヒト全血液暴露のex vivo分析のためのユニークなツールです。このシステムは、密接に血液接触面に関連する多くの生理学的エンドポイントの分析を可能にする、さまざまな医療処置に使用される臨床血液導管を通る血液の灌流に似ている。ポリマー表面へrecCD47の付属物のための生理学的エンドポイントとして、DAPI染色（ 図4）および走査電子顕微鏡法（ 図5）を用いて細胞計数を用いた。他のエンドポイントは、ポリマー血液導管を通して血液灌流前後の細胞数を使用することもできる、例えば、機器の可用性に応じて、使用することができる。それにもかかわらず、recCD47が修飾された表面は、変更されていないコントロールサーフェスと比較して有意に少ない接着した細胞を示した。これらのダtaはrecCD47がポリマー表面に生体適合性を伝え、潜在的に、ポリマーの血液導管を用いた臨床手順でFBRを防止するために使用することができることを示唆している。 これは広く血液灌流研究のためのin vitroモデルで使用されるが、それはいくつかの点で制限されている。この方法の2つの主要な欠点​​は、血液サンプルをチューブ内の空気を含むことを要件から生じる。空気との頻繁な血液の相互作用は、特定のエンドポイントを妨害する可能性の白血球と血小板凝集とタンパク質の変性16-18を引き起こす可能性があります。第二に、空気が血液循環19の速度を制限し、回路の最高点のままである。この方法の明らかな制限があるにもかかわらず、それが競合する方法19未満の血液損傷を誘発し、ポリマー性血液導管の電位の生体分子の生体適合性をスクリーニングする方法として機能します。候補生体分子はを通して識別されるとこの方法は、さらなる分析は、 インビボ動物モデルによって得ることができる。最終的に、変性されたポリマーの生体適合性は、in vivoモデル系における適切なを使用して確認する必要がある。

そのような人工心肺や腎臓透析などの多くの臨床手順は、ポリマー血液導管の使用を必要とし、多くの場合、術後の合併症1に関連している。血液で灌流すると、これらのポリマーは血液タンパク質および血小板、単球/マクロファージ付着の吸着、その結果、異物反応（FBR）を誘発（illicit）、および、術後の合併症に寄与する全てが炎症誘発性サイトカインの放出/またはデバイスの故障2,3。したがって、この問題に対処するための戦略は、生体材料研究の重要かつ継続的な地域のまま。研究者らは、生体活性または生体不活性分子を4-6と表面を接触させること、血液を変更することによってこの問題に対処しようと試みてきた。私たちの研究室での研究は、FBRを軽減し、これらの材料の有効性を高めるための戦略として、高分子生体材料への組換えCD47（recCD47）を追加に焦点を当てている。 CD47は遍在的に発現transmembrです細胞7-10やショーを表現する際の免疫回避の既知の役割、付与「自己」ステータスを持つメタンタンパク質がポリマー表面11-13に付加するとき、生体適合性を付与するに約束します。シグナル調節タンパク質α（SIRPα）、CD47のための同族受容体、および膜貫通タンパク質のファミリーを含有免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ITIM）のメンバーは、骨髄起源14の細胞に発現しています。私たちは、以前にCD47は、SIRPαを介した細胞シグナリングを介して、 インビトロ 、 エキソビボでポリウレタン（PU）、およびポリ塩化ビニル（PVC）に対する免疫応答を下方制御、およびin vivoモデル 11-13 にすることを実証した。 私たちの研究の中心は化学的に反応性のチオール基が共有結合多官能性ポリマー（PDT-BZでチューブを反応させることによって、ポリマーのチューブに追加された、本明細書に記載され、比較的小説光活性化化学で2 -ピリジルジチオ（PDT）から成る）Phは、光反応性ベンゾフェノン（BzPh）とカルボキシ変性ポリアリルアミン11-13。トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）11と共有結合的に付加さPDT基を還元すると、続いて治療的部分と反応させることができるチオール化表面が得られる。本明細書に詳述以前12,13、さらなるC末端のポリ-リジン尾部12,13の添加によって修飾されrecCD47は、スルホスクシンイミジル-4 - [N -maleimidomethyl]シクロヘキサン-1カルボキシレート（スルホ-SMCC）と反応させて1時間チューブとrecCD47 11との間のモノスルフィド結合形成を可能にする、チオール反応性基を生成する。 CD47官能化された表面の抗炎症能力がもともと血栓凝固15 のin vitroモデルとして1958年に記載されたヒト全血、チャンドラーループ装置を使用して、 元VIV O、試験した。この装置は、に依存していますチューブ部分的に空気を充填システムとチューブ15に血液を循環させる回転モータを閉じた。この実験モデルは、修飾および非修飾表面の際に血液暴露の影響、ならびに血液の細胞の生理時にこれらの表面修飾の効果を検討する機会を提供する。 recCD47は、この光活性化化学を用いてポリマー表面の多様に付加することができ、その抗炎症能力は、ポリマー表面11,12の上に血液灌流を模倣する臨床的に関連エキソビボモデルを利用することによって評価することができる。 recCD47で修飾された臨床グレードの血液導管は、装置内のヒト血液にさらされたときに、未修飾ポリマーと比較して有意に低い血小板および炎症細胞の付着を示す。この変形プロセスのステップバイステップの説明は、以下に詳述する。

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>58906</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>VWR</td><td>AAA17876-AP&amp;nbsp;</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td><td>Synthesized in lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate</td><td>Sigma</td><td>S5770-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Leica</td><td>DC500</td><td>Out of production</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547-100ML</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Human CD47 (B6H12) &amp;ndash; FITC Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-12730</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Acros Organics</td><td>197450050</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Potassium Bicarbonate (KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td><td>Terumo Cardiovascular Systems</td><td>60050</td><td>Most clinical-grade tubing will work</td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JSM-T330A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>Spectramax Gemini EM&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Sigma</td><td>M6035-10MG</td><td>Moisture Sensitive!</td></tr><tr><td>tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>H-1200</td><td>Light sensitive!</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalt Columns &amp;ndash; 7 K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>89891</td><td></td></tr></tbody></table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

合成表面は、身体に導入されたときに異物反応が起こる。これは、術後の合併症につながる、血液タンパク質の吸着および血小板の付着およびそれに続く活性化、単球/マクロファージの接着性、および炎症性細胞シグナル伝達事象によって特徴付けられる。チャンドラーループ装置は、研究者が、血液の大量のは、ポリマーの導管を介して灌流されているときに発生する分子や細胞間相互作用を研究することを可能にする実験的なシステムです。そのために、この装置は、各種高分子表面修飾の抗炎症特性の評価を可能にex vivoでのモデルとして使用されてきた。当研究室では、共有結合した組換えCD47と光活性化化学により修正された血液導管は、ポリマー表面に生体適合性を付与することができることが示されている。ポリマー表面にCD47を付加することは、ポリマーの血液導管の有効性を促進するための有効な手段である可能性があります。彼女のEINはCD47修正されたと制御導管と血液の相互作用を調べるために臨床的に関連性ポリマー血液導管および ex vivo実験モデルとしてチャンドラーループの使用に組換えCD47を追加するために使用される光活性化化学を詳細に方法論である。

SMCCを用いて、チオール反応recCD47のポリリジンと一緒にPDT-BzPhおよびTCEPを使用することにより、チオール反応性高分子表面の生成は、ポリマー表面にrecCD47の取り付けが可能になります。修正処理は、 図1に概略的にまとめられている。この変更処理の利便性タンパク質は、アミン含有リジンのような十分な化学的反応基で修飾することができると仮定すると、それは多くの異なるタンパク質、多くの異なるポリマー表面に適用することが可能であるとポリマーが十分に使用可能な炭化水素を有している。 それはrecCD47このプロトコル11-13を用いてポリマー表面に付加することができることが以前に実証されている。 図3Aに示されるように、有意なFITC染色はDIC画像で示すように膜に特異的に局在化されるCD47の細胞外IgドメインにFITC結合抗体を用いて、recCD47することも可能である（ 図3B）。これらの結果は、recCD47が共有ポリウレタンフィルムに結合させることができることを示している。蛍光単位を測定し、標準曲線と比較することは、表面に結合したrecCD47の濃度を決定した。私たちは、recCD47 500 ngの/ cmで2,11-13を超えたレベルでポリマー表面に付加することができることを示した。これらの結果は、このチオール系ポリマー修飾プロトコルはポリマー表面にポリ - リジン修飾された組換えタンパク質を付加するために使用することができることを確認する。 CD47は、炎症性細胞の付着および免疫系の活性化7-13を予防する」、自己」のマーカーであることが示されている。 ex vivoでの設定で可能な限り厳密に、生体内の状態に模倣するために、ヒト全血がチャンドラーループ装置における非修飾および変更されたポリマーチューブを通して灌流することができる（ 図2参照）。チューブへの細胞接着は、（DAPI染色によって評価することができる<s·チョン&gt;図4）とSEM（ 図5）。 DAPI染色により得られた細胞数た（p = 0.004）有意にrecCD47を添付の非修飾表面（ 図4Aおよび4B）と比較して細胞接着を阻害することを実証する。 DAPI細胞数は、非修飾およびrecCD47修飾表面への細胞接着（ 図5）の同様のレベルを示す、SEMにより確認した。これらのデータは、有意に血液灌流のex vivoモデルにおける炎症性細胞の付着を阻害する、本明細書に記載のプロトコルを用いて、recCD47の付属物を示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig1highres.jpg" /> 表面改質の図1の回路図。 A）チオール化ポリマー表面は、光活性化架橋剤PDT-BzPhおよびTCEPを用いたその後の減少と高分子表面をインキュベートすることによって生成した。B）&lt;/ strong&gt;のSMCCは、その後recCD47官能化表面を得るために、合成チオール化表面と反応させて、チオール反応性recCD47を製造した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig2highres.jpg" /> チャンドラーループ装置の2ダイアグラム図。 A）この装置は、回転モータに取り付けられた金属製ポールに固定された車輪を回転させ、37℃に加熱した水浴で構成されています。これはセットアップすることにより、チューブを通る血液の37℃の水槽や灌流への管の一部を沈めると、車輪を回転させる回転モータを可能にします。B）金属のアダプタがループを形成するチューブの両端を接続するために使用されている回転車輪の1の周り。血液は、金属バルブポートを介してチューブに加え、バルブキャップでキャップされている。C）が組み立てられると、チューブと金属弁がぴったりとフィットアルべき空のチューブを用いて以下に示すように、回転ホイールをound。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig3highres.jpg" /> ポリウレタンフィルム上recCD47の3量子図 。 CD47の外Igドメインに対する抗体は、ポリウレタンフィルムに結合したrecCD47の量を定量するために使用された。 recCD47のFITC検出を示す適切なフィルターセットを200X倍率で撮影した蛍光顕微鏡画像は、ポリウレタン（A）に追加。 （B）DIC画像は、FITC信号がポリウレタンフィルムに特異的であることを示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig4highres.jpg" /> 非修飾およびrecCD47変性ポリウレタンに、図4の細胞接着 。ヒト全血を採取し、上で灌流した非修飾またはrecCD47が修飾された3時間のPUフィルム。 3時間の灌流後、フィルムをDPBSですすぎ、そして付着した細胞を4℃で一晩、4％PFAで固定し、DAPIを室温で30分間染色した。 DAPI-染色された細胞を200倍の倍率と適切なフィルターセットの下で蛍光顕微鏡を用いて計数した。ビューの（A）9ランダムに選択されたフィールドは、各修正を計数した。 （B）データビューの9の視野の代表であり、平均値±標準誤差た（p = 0.004）のように表される。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig5highres.jpg" /> recCD47図5のSEM分析は、変更されたと制御面は、ex vivo分析を以下 。ヒト全血を採取し、3時間非修飾またはrecCD47で修飾されたPVCチューブ上で灌流した。代表的な画像をunmodifiに重要な細胞接着を示しているrecCD47で修飾された表面は時折添付セルを表示しながら、表面を編

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The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

の使用<em&gt;生体外</em&gt;チャンドラーループ装置は、改質ポリマー血液導管の生体適合性を評価するための

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.5K ビュー.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

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Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

生物工学

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

トライリーフレットポリマーバルブの相対的な流体力学的評価のためのプロトコル

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em&gt;エクスビボ</em&gt; Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

発生生物学

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

工学

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

光干渉断層計を用いた分解足場ベース組織設計血容器開発の非破壊モニタリング

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

ヒツジの静脈コンプライアンス評価のための3D血管造影

Quantifying Inferior Vena Cava Compliance and Distensibility in an In Vivo Ovine Model Using 3D Angiography

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native vessel into which they are implanted. Compliance matching with the native vessel is emerging as a key property for graft success. The current gold standard for assessing vessel compliance involves the vessel's excision and ex vivo biaxial mechanical testing. We developed an in vivo method to assess venous compliance and distensibility that better reflects natural physiology and takes into consideration the impact of a pressure change caused by flowing blood and by any morphologic changes present. 
This method is designed as a survival procedure, facilitating longitudinal studies while potentially reducing the need for animal use. Our method involves injecting a 20 mL/kg saline bolus into the venous vasculature, followed by the acquisition of pre and post bolus 3D angiograms to observe alterations induced by the bolus, concurrently with intravascular pressure measurements in target regions. We are then able to measure the circumference and the cross-sectional area of the vessel pre and post bolus. 
With these data and the intravascular pressure, we are able to calculate the compliance and distensibility with specific equations. This method was used to compare the inferior vena cava's compliance and distensibility in native unoperated sheep to the conduit of sheep implanted with a long-term expanded polytetrafluorethylene (PTFE) graft. The native vessel was found to be more compliant and distensible than the PTFE graft at all measured locations. We conclude that this method safely provides in vivo measurements of vein compliance and distensibility.

著者スポットライト:先天性心疾患研究における血管新生発生のためのイメージングの改善

This protocol allows for the in vivo quantification of venous compliance and distensibility using catheterization and 3D angiography as a survival procedure allowing for a variety of potential applications.

3D血管造影法を用いた In vivo ヒツジモデルにおける下大静脈のコンプライアンスと拡張性の定量化

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native ...

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