Name: static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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Hirschilトラスト、マイケル·セイパースタインメディカル学者研究費、およびニューヨーク大学ホワイトヘッドの交わりは、この作品を支持した。

1。マイクロプレートのウェルをコーティング注記：このステップの目標は、T細胞のLFA-1のリガンドとして機能するように、ICAM-1とのコートポリスチレン表面にある。 <ol><li>次の解決策を準備します。 <ol><li>再懸 ​​濁することによりコーティング溶液を調製した組換えICAM-1カルシウム（1mMの富化リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、pH7.4）で塩化カルシウム）とマグネシウム（2 nMのMgCl 2を ）。 ICAM-1の最終濃度が0.7 mg / mlの原液から作られ、-80℃の冷凍庫に保管10μg/ mlの、であることを確認してください。 </li><li> 0.5％のヒト（またはウシ）血清アルブミン（HSA / BSA）、2mMのMgCl 2、および1mM CaCl 2でPBSを濃縮することにより、接着溶液を調製する。 </li><li> PBSに2 MgCl 2および1mMのCaCl 2を追加することにより、洗浄溶液を調製する。 37へのすべてのソリューションを温める使用前にCと°。 </li></ol></li><li>洗浄溶液50μlで24個のウェルを洗浄します。これは洗っていない井戸、正（PMA処理した細胞）、および負（コーティングされていない井戸）のコントロールが含まれます。各条件は、少なくとも3つのウェル（三重）を設定するため。 </li><li>各ウェルにコーティング液50μlを追加します。コー​​ティングされていない対照ウェルに追加しないでください。 37℃のインキュベーター内部の1時間インキュベートする。 </li><li>先端がウェルの底に触れることなく、穏やかに塗布液を吸引する。洗浄溶液50μlで1回洗浄する。 </li><li>接着溶液50μlを加え、37℃のインキュベーターの内側1時間マイクロプレートをインキュベートする。 </li><li>吸引除去優しくおよび50μlの洗浄溶液で1回洗浄する。しかし、それは一晩4℃で保管し、そして次の日、それを使用することが可能で、同じ日にプレートを使用する。 </li></ol>血液からの2。のT細胞単離<ol><li> 50μL/ mlのOにおけるヒトT細胞濃縮カクテルを追加F全血（ 例えば抗凝固剤の3ミリリットル（ヘパリン、EDTA、またはクエン酸塩）、全血の場合、カクテル150μlのを追加します）。よく混ぜる。 </li><li>室温で20分間インキュベートする。 </li><li> 50ミリリットルの遠心管に処理された血液と室温で1％のD-グルコースで強化し（カルシウムとマグネシウムを含まない）等容量のPBSの3ミリリットルを追加。パスツールピペットを用いて穏やかに混合。 </li><li>遠心チューブに15ミリリットルフィコール·パックPLUSを追加します。 </li><li>慎重にリンパ球分離培地上で血液サンプルを希釈し、層を6ml。 </li><li>休憩をオフにして20℃で20分間400×gで遠心します。 </li><li>界面で乱されていないリンパ球層を残して、きれいなパスツールピペットを用いて上層を取り除く。 血漿の上層は後の使用のために保存することができる。清浄なパスツールピペットを使用して清浄な遠心分離管にリンパ球層を移す。 </li><li>リンパ球にPBSを3容量（9ミリリットル）を追加します。そっとして細胞を一時停止DRAウイングその中およびパスツールピペットから。 </li><li> 20℃で5分間、400×gで遠心分離する</li><li>上清を取り除きます。リンパ球はこれで、アプリケーションに適した媒体に懸濁されるべきである。 20ml中のT-75培養フラスコに細胞を移し、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地。 </li></ol>細胞の3。準備注意：細胞を蛍光試薬で標識するための前提条件である。このプロトコルでは発現細胞が許容される代替物であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）であるが、緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用する。 <ol><li>血球計数器を用いて2.4×10 6 T細胞（各ウェルのための1×10 5）を数える。 </li><li> （血清飢餓）は、血清を欠く培地中で細胞を再懸濁。 37℃のインキュベーター内で2時間細胞をインキュベートします。 </li><li> 5分（400×g）で細胞を遠心分離する。培地を吸引除去し、1ミリリットルのPBSに懸濁します。 </li><li> 1:1000希釈（5 mMまで行わストック）でCFSEを追加します。光からカバーし、室温で8分間インキュベートする。 </li><li> 37°CのPBS 10mlに添加することにより反応を停止し、5分間400×gでスピン。 </li><li>再懸 ​​濁予め温めた接着溶液（501μl当たり1×10 5細胞）を1.2 mlの細胞ペレットを再。 </li></ol> 4。細胞の刺激を注：接着を開始するために、細胞が刺激されなければならない。以下の実験では、細胞を抗CD3抗体を用いて架橋するTCRを介して刺激されるが、可溶性SDF-1は、代替として役立ち得る。実験の目的に応じて、様々な薬理学的試薬は、細胞接着への影響を研究するために、刺激の前又は間に添加することができる。ホルボールミリステートアセテート（PMA）は、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（DAG）と構造的に類似であり、したがって、複数のキナーゼを活性化ホルボールエステルであるTCRの下流側（主にプロテインキナーゼC）だ;ここでは陽性対照として使用する。 <ol><li> 37℃にマイクロプレートを温める</li><li> 8空の1.5mlチューブ（各チューブに150μl）、各条件1のチューブに細胞を分割します。 </li><li>それに応じて細胞を処理： <ol><li>ポジティブコントロールとして、10 ng / mlのでPMAで1チューブを刺激する。刺激のためのコントロール（「刺激なし」）、未洗浄ローディングコントロール（「NOウォッシュ」）、およびICAM-1コーティングのための制御（「コーティングされていない」）として機能するように、未処理の3つの管を保管してください。 </li><li>抗CD3抗体の異なる濃度（0.1、1、5、および10μg/ ml）を用いて4つのチューブを刺激する。遅延することなく、次のステップに進みます。 </li></ol></li><li>各ウェルの空に刺激された細胞の混合物のアリコート50μlを。ウェルあたりの細胞の最終的な数は、1×10 5である。 </li><li> 15分間37℃のインキュベーター内でマイクロプレートを置きます。 注：一部のT細胞株は、短い刺激に対するが必要です<html>のTiON時間。この時間の間に、細胞がウェルの底に落ち着くし、標的リガンドに準拠しています。 </li></ol> 5。洗い流す非接着細胞注記：このステップの目標は、リガンドでコーティングされた表面との緊密な接触を形成することができませんでした細胞を除去することです。同一の物理的な力を全てのウェルに適用されることを確実にするために、このステップのマルチチャンネルピペットを使用する。これは、接着細胞のパーセンテージの計算を補助するために示された未洗浄の対照ウェルに保つことが重要である。 <ol><li>各ウェルに温かい接着溶液150μlを加える。ウエルから培地を除去する前に数秒間静かにプレートを振る。ヒントウェルの底に触れないでください。 </li><li>この手順を3回繰り返します。内と外のバッファをピペットときピペットの方向を変える。 </li></ol> 6。接着細胞の割合の判定_content &quot;&gt;注意：このステップでは、蛍光プレートリーダーは、各ウェル内の蛍光強度を測定するために使用される強度は接着細胞の数と直接相関する。 <ol><li>プレートリーダーをオンにします。デスクトップ上のショートカットアイコンをクリックして、プレートリーダー·ソフトウェアを開きます。 <ol><li> 「タスク」メニューの新しいプロトコルを設定するには「新規」をクリックします。 </li><li> 「アクション」メニューから「読み込み」オプションを選択します。 「蛍光強度」をクリックして、「OK」のタブを押してください。 </li><li>ドロップダウンメニューから「励起波長485」と「発光波長528」を選択します。 「OK」のタブを押してください。 </li><li> 「光」オプションメニューで「ボトム」を選択し、「OK」のタブを押してください。バック「アクション」メニューに移動し、37℃に温度を設定し、「OK」をクリックしてください。 </li><li>プレートリーダーにマイクロプレートを挿入し、「ファイル名を指定して実行」をクリックしてください。結果はExcelスプレッドシートにエクスポートされます。 </li></ol></li><li>以下の式を用いて接着細胞のパーセンテージを計算する： 接着細胞のパーセンテージ=（洗浄後のウェルで読み取る平均蛍光強度）/（未洗浄細胞において読み出さ平均蛍光強度）×100％。 </li></ol>

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	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

LFA-1活性化およびT細胞の接着12に信号を研究するためのいくつかのアッセイがある。フローサイトメトリーは、屈曲またはLFA-1の拡張のいずれかに選択的に結合するモノクローナル抗体を用いて生細胞におけるLFA-1の親和性の状態を測定するために使用される。この方法の制限の1つは、それが考慮インテグリン &#39;結合活性をとらないことである。遊走アッセイは、便利なツールですが、彼らは、特定の時点でちっぽけな接着をしない移行を測定し、。 Tリンパ球の遊走（ 例えば皮膚過敏症モデル）を研究するマウスモデルは、生理学的に関連するものですが、これらのモデルを利用することは、実行する多因子性と複雑です。ここで説明する静的接着アッセイの主な強みは、簡単な方法で結合活性および親和性の両方を測定する能力である。この方法の別の利点は、迅速かつ正確に少数の細胞を検出する能力である。他の方法と比較した場合には、マニピュレータにはるかに容易であるキュレート細胞と我々が説明するものとして機能アッセイにおいて異なる試薬とそれらを扱う。また、接着細胞をプレートリーダー、手動カウントに関連付けられている除去バイアスが客観的にカウントされます。この方法は、接着工程で複数の薬剤や遺伝子操作の効果をスクリーニングするために使用することができる。 しかしこの手法には限界がないわけではない。つの潜在的な弱点は、接着細胞の割合は、他の1の実験と異なる場合があり相対数、であるという事実である。別の弱点は、これらが新たに単離しなければならないのでブラストリンパ球が、使用することができないという事実である。また、凍結末梢血単核細胞から回収した細胞との接着の研究は一貫していない。それは、PMAが一貫して動作する必要があることを言及することが重要であり、我々は、すべての実験でそれを使用することをお勧めします。正と負の制御が失敗した実験のトラブルシューティングの最初のステップです。性を欠いている場合刺激された細胞に接着を増強し、井戸をカバーする標的リガンドの濃度をチェックする必要があります。それに加えて、細胞の95％以上が生存可能であり、細胞株の場合には、それらの増殖期を計算する必要があることを検証するために必要とされる。同じ条件の中の重要な変動性の場合には、（三連以上）以上の3つの同一の井戸を使用することをお勧めします。 このアッセイを理解するためには、いくつかのこのようなインキュベーション時間などのプロトコルにおけるステップおよび播種した細胞の数は、すべての条件の間で均一でなければならないことを理解することが有用である。インキュベーション時間のわずかな差が生じることが不正確な測定である。それは正確に同じ数の細胞を各ウェルでも一定分量に不可欠です。この技術の将来のアプリケーションは、その精度を向上させることが、細胞をロードして、より客観的な方法での洗浄を行うことになる自動化されたバージョンになります。また、自動化されたバージョンでは、私たちにできるようになります大規模スクリーニングを行う。

Tリンパ球の接着は、免疫応答1と基本的な処理である。これは、標的細胞に2リンパ節内の細胞（APC）に抗原提示を走査するため、および免疫学的シナプスの形成のために、内皮細胞が毛細血管壁を装飾するとT細胞の相互作用のために（IS）が必要である。これらの要件は、機能的にも速度論的に区別される。リンパ球の血管外漏出のプロセスは、化学誘引、ローリング、強固な接着、移住から構成されています。接着を会社にローリングからの移行が急速にGタンパク質共役受容体シグナルに応答するT細胞を必要とします。この応答は、細胞ローリング3を遅くし、逮捕インテグリンリガンド相互作用が得られます。インテグリン結合活性の即時の変化は、このプロセスを仲介する。移行は「フロントエンド」と「後端」の癒着の破損で癒着の形成と動的な相互作用のbetweenTcellsおよび内皮細胞を必要とする形成し、4を壊す約分間隔で。 ISはinminutesを形成するが、時間6用にそのまま残る必要があります。 興味深いことに、ある接着分子、インテグリンファミリーメンバーリンパ球機能関連抗原（LFA） -図1は、これら全ての方法5に必須である。 LFA-1は、免疫グロブリンスーパ​​ーファミリーのいくつかのメンバーとの相互作用を介して接着を媒介する。 LFA-1の最も高い親和性を有する最も広く研究リガンドは、細胞間接着分子（ICAM）-1である。非活性循環リンパ球は、細胞表面上に低親和性LFA-1を発現し、従って、ICAM-1でコーティングされた表面に付着することができない。 LFA-1の親和性は、可変ならびにT細胞受容体（TCR）によって媒介されるGタンパク質共役受容体の活性化、サイトカイン刺激、および信号などのいくつかのシグナル伝達事象によって調節される。LFA-1が得られた高親和性形態は、細胞外空間への細胞内活性化を搬送するTICAM-1との相互作用hrough。この経路は、7シグナリングインサイドアウトと呼ばれている。同様に、細胞外の空間から、LFA-1を介したシグナル伝達は、アウトサイド·インのシグナリングと呼ばれています。 インサイドアウトやアウトサイドインシグナル伝達に関与カスケードの細胞内シグナル伝達は、現在の研究の主要な焦点である。低分子量GTPase Rap1のは、最近、それは、TCRライゲーションおよび8サイトカインシグナルの両方に共通しているシグナルインサイドアウトの重要な要素として浮上している。インテグリン活性化のRap1の重要な役割は、T細胞の接着が、ドミナントネガティブ型Rap1 9の発現によって遮断される一方のRap1の過剰発現は、T細胞のインテグリン依存性接着を刺激するという発見により強調される。 Rap1のによるインテグリン規制の我々の理解におけるこれらの進歩は、in vitroのツールで使用して達成されてきた。これらの中でも、ここで説明した静的接着アッセイである。 この方法の全体的な目標は、Tを研究することであるICAM-1をコーティングした表面への細胞接着。具体的には、客観的に測定し、異なる条件下で、リアルタイムで生細胞におけるそのカウンターリガンドに向かってLFA-1の親和性を定量するために使用される。この技術は、T細胞と相互作用する細胞の表面を模倣するようにICAM-1でコーティングしたポリスチレンウェルを使用する。多くの前述の静的T細胞接着アッセイは、実験的に複雑であった。これらのアッセイは、しばしば、培養されたウシ角膜細胞は、T細胞の接着のための基質として細胞外マトリックスを作成するために利用される放射性標識するT細胞に必要な、またはT細胞の接着10を促進するために拡張された期間にわたって非生理学的T細胞刺激を求めた。多くの他のアッセイシステム11で利用されるように、フローサイトメトリーおよび顕微鏡流れと比較して、接着インキュベーション後のT細胞を定量するための蛍光測定の使用は、定量化のより高感度かつ正確な方法である。さらに、単一細胞microscopインテグリン局在のIC分析では、蛍光の測定と同様に広範な、人口ベースの分析のために許可していません。活性化状態特異LFA-1抗体が市販されているが、これらの抗体は、ここで説明する方法に比べて低い感度を提供します。代替技術上の主な利点は、その単純さと、同時に複数の実験条件を確認できることが挙げられます。特定のアプリケーションのためにこの方法を検討する場合、一方はT細胞が負に、選択された新たに単離され、蛍光マーカーで標識されるべきであることを考慮すべきである。

<table><tbody><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hybrid</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate with optical bottom</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant ICAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibodies</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS containing calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral lymphocytes</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 software</td><td>BioTek</td><td>Version 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 ml centrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 culture flasks</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep T cell enricment kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

Tリンパ球の接着は、炎症および抗原提示細胞との免疫学的シナプスの形成部位への遊走を含む複数のT細胞機能に必要とされる。 T細胞は、インテグリン、パートナー細胞または細胞外マトリックス上の標的分子と相互作用する膜貫通タンパク質のヘテロ二量体対からなる細胞接着分子のクラスの接着特性を制御することにより調整された接着性を達成する。最も顕著なT細胞は、インテグリンリンパ球機能関連抗原（LFA）-1サブユニットが標的細胞内接着分子（ICAM）-1αLおよびβ2から構成である。接着を制御するためのT細胞の能力は、個々のインテグリンの親和性の状態を調節する能力に由来する。インサイドアウトシグナル伝達は、細胞内のシグナルがインテグリンの外部ドメインが活性化された状態を想定する原因となるプロセスについて説明します。これらの複雑な現象の私たちの知識の多く​​は、機械論に基づいていますin vitroモデル系で単純化された中で行われた研究。ここで説明するTリンパ球接着アッセイは、T細胞は、静的な条件下で、標的分子に付着させることができ、その後、接着性を定量化するために、蛍光プレートリーダーを利用する優れたツールである。このアッセイは、リンパ球に作用する接着刺激または阻害する物質を定義するだけでなく、関係するシグナル伝達事象を特徴づけるに有用であった。 LFA-1のためにここで説明したが - ICAM-1仲介接着;このアッセイは、容易に他の接着相互作用（ -フィブロネクチン例えば、VLA-4）の研究を可能にするように適合させることができる。

以下の抗CD3抗体の種々の濃度で刺激した一次T細胞を用いて接着アッセイの一例である。これは、未洗浄細胞（ すなわち合計ローディング）の蛍光を知っておくと便利です。非刺激細胞は、陰性対照としての役割を果たし、PMA処理細胞は、抗CD3抗体の陽性対照である。コー​​ティングされていないウェルで播種した細胞は、ICAM-1のコントロールとして機能します。非刺激細胞の割合が5％〜10％の間であり、一方典型的な実験では、付着PMA処理細胞のパーセンテージは40％〜50％の間である。細胞接着性を定量化する別の方法は、非刺激細胞のそれ以上の各条件での蛍光強度の計算倍増加することによるものである。 表1は、CFSEの蛍光強度は、可溶性抗CD3抗体の異なる用量で刺激し、ICAM-1被覆ウェル上にプレーティングし、一次T細胞を標識示す。 図1は、代表的なイムを示す同様の実験歳。細胞は負に末梢血から選択した。 2時間の血清飢餓の後、2.4×10 6細胞を、種々の濃度の可溶性抗CD3抗体による刺激に続いてCFSEで標識した。刺激された細胞は、ICAM-1をコーティングしたウェルにプレーティングし、暗所で15分間インキュベートした。インキュベーション後、非接着細胞を3回洗浄し、蛍光強度を485nmでプレートリーダーを用いて測定した。 PMAで処理し、非刺激細胞を対照として使用した。最初の列（1A〜1C）は洗浄しなかった細胞（総負荷、 例えば 、100％）が含まれていることに注意してください。 図2は、表1に報告した蛍光強度に基づいて計算されたT細胞の接着のパーセントを示している。（ロードされた全細胞のう ​​ちすべての条件について3つのウェル（トリプリケート）の平均強度を計算し、相対的なパーセンテージに変換<stroNG&gt;表1;コラム1）。平均値の標準誤差をそれぞれの条件について計算した。同図に示すように、接着細胞のパーセンテージは、刺激のために使用される抗CD3抗体の濃度が高いと大きくなる。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td>なし洗濯ません</td><td>コー​​ティングされていない</td><td>刺激されていない</td><td> PMA </td><td>抗CD3 0.1μg/ mlの</td><td>抗CD3 1μg/ mlの</td><td>抗CD3 5μg/ mlの</td><td>抗CD3 10μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> A </td><td> 89652 </td><td> 611 </td><td> 5219 </td><td> 45873 </td><td> 8964 </td><td> 20157 </td><td> 37972 </td><td> 37972 </td></tr><tr><td> B </td><td> 90248 </td><td> 320 </td><td> 6049 </td><td&gt; 44698 </td><td> 7568 </td><td> 25486 </td><td> 32549 </td><td> 32549 </td></tr><tr><td> C言語</td><td> 88321 </td><td> 409 </td><td> 5456 </td><td> 42697 </td><td> 8542 </td><td> 24568 </td><td> 32892 </td><td> 3289 </td></tr></tbody></table> CFSEの表1の蛍光強度値は、可溶性抗CD3抗体の種々の濃度で刺激した一次T細胞を標識した 。新たに採取した細胞を、血清を2時間飢餓状態にし、その後、5μMの濃度でCFSEで標識した。次に、細胞を、低（0.1μg/ ml）を用いて刺激し、培地（1μg/ ml）を、ハイ（5μg/ ml）を、非常に高い（10μg/ ml）を、可溶性抗CD3抗体の濃度および1 ×10 5細胞（ICAM-1で予めコーティング）を各ウェルに播種した。 15分後、非接着細胞を、3つのシリアル回洗浄することにより除去した。接着細胞の数をsとして、プレートリーダーで測定したこの表のhown。ウェルズ1A-1C：未洗浄細胞; 2A-2C：コーティングされていない井戸; 3A-3C：刺激されていない細胞;図4A〜図4C：10 ng / mlのPMAで刺激した細胞;図5A〜5C：低用量の抗CD3抗体で刺激した細胞;図6A〜6C：抗CD3抗体の中用量で刺激された細胞;図7A〜7C：高用量の抗CD3抗体で刺激した細胞;図8A-8C：非常に高用量の抗CD3抗体で刺激した細胞。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1.jpg" /> 図1可溶性抗CD3抗体の種々の濃度で刺激し、一次T細胞の画像 。新たに採取した細胞を、血清2時間飢餓状態にし、その後、5μMの濃度でCFSEで標識した。次に、細胞をPMA（10 ng / mlの）または抗CD3抗体の種々の濃度（0.1、1、5、および10μg/ ml）を用いて刺激し、上にプレーティングしたICAM-1の表面をコーティングした。代表的な画像は、20倍の倍率を用いて、ツァイス700共焦点顕微鏡で撮影した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51646/51646fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2.jpg" /> 図2に増加密着性の高用量の抗CD3抗体の結果とT細胞の刺激は細胞を未洗浄するために、表1に示す。接着細胞の割合の平均を計算した相対から計算されるT細胞の接着のパーセント。グラフ化表現その100パーセントを表す。ヒストグラムは、少なくとも3つのウェルの結果を（平均±SEM）を提示。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51646/51646fig2large.jpg" target="_blank">CLICしてください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをkである。

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

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15.9K ビュー.  New York University School of Medicine. 静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。 

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

免疫・感染学

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

生物工学

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

ヒト好中球におけるβ2インテグリン活性化阻害剤のスクリーニング

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

著者スポットライト:β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを同定する方法の開発 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

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移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

用接着周波数アッセイその場で速度論解析

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ