著者は有用な議論や作業のための非常に貴重な議論と助言し、バチェレラボのすべてのメンバーのためのS.ダグラスに感謝したいです。この作品は、生命科学の学部とバー - 宜蘭大学のナノテクノロジー＆アドバンストマテリアル研究所からの助成金によってサポートされています。

ステープルズプール混合物の調製<ol><li> 表1に記載された96ウェルプレート上に凍結乾燥したDNAナノロボットのステープルを注文（材料を参照）、10ナノモルに正規化します。 DNAのナノロボットの設計とアーキテクチャの詳細についてはベン・Ishay ら 14、ダグラスらを参照してください。15）。 </li><li> 100μMの濃度にDNアーゼ/​​ RNaseフリーの超高純度でうまく各ステープルを再構成します。ステープルが10ナノモルに正規化するために、超純水100μlで再構成します。 </li><li>プール一緒にマルチチャンネルピペッターおよび滅菌55ミリリットルソリューション流域を使用して、各ステープルの20μlの。 注：ナノロボットの形状（コア、エッジ、ハンドルおよびガイド配列を含む、 表1）254短 ​​鎖から構成されているので、ステープル・プール内のステープルの各々の濃度は394 nMです。ステープルプールからステープルを削除するか、別の巻でのいくつかを追加しますリューム、かなりの収率を減少させる、またはそれ以外の場合は折り畳まれていない集合体になることがあります。 </li></ol>製作反応混合物の調製<ol><li>標準的な反応混合物について（材料を参照してください 、100 nMの原液）足場DNAの4ピコモルに対応し、M13mp18のウイルスゲノム環状一本鎖DNAを40μlを使用しています。製造混合物中の足場の最終濃度は20 nMで、最終容量200μlのです。 <ol><li>具体的なニーズに応じて足場DNAの量を調整します。しかしながら、一定の20 nmで反応混合物中の骨格DNAの最終濃度を保ちます。 </li></ol></li><li>それぞれ、1〜10のステープル比に足場に到達するためにステープルを加えます。 20nMの足場DNA濃度について、ステープル254 &#39;の最終濃度の各々は、200nmです。 200μlの最終反応容量についてステープルプール混合物（セクション1.2）の102μlを添加します。 <ol><li>目に別々に特定のゲート列を追加します。Eは、この時点で、反応混合物を折り畳みます。これらのオリゴは別途注文し、HPLC精製を必要としています。 20 nMの足場濃度について各オリゴのすなわち 200 nMの、ゲートオリゴ1:10足場ゲートにシーケンス比で存在することを確認してください。 200μlのフォールディング反応容量については、100μMのストック濃度で4門オリゴのそれぞれについて、0.4μlを添加します。 </li></ol></li><li> 1×TAE（40mMのトリス - 酢酸、1mMのEDTA）の最終濃度に到達するために10倍TAEストック緩衝を追加します。 200μlのフォールディング反応容量の場合、10倍TAEの20μlを添加します。 </li><li> 10mMの最終濃度まで、1MのMgCl 2を加えます。 200μlのフォールディング反応容量は、1 MのMgCl 2の2μlを添加します。 </li><li> 200μlの最終容量に到達するためのDNase / RNaseを含まない超純水36μLを加えます。 </li><li> PCRバイアルにボルテックスし、アリコート100μlのサンプル。 注：使用される最大反応体積に関するサーマルサイクラーの仕様を参照してください。これらの制限を満たすために音量を小さくすると得られた収率は減少しません。指定された最大上記の反応ボリュームは利回りを危うくします。 </li></ol>製造反応の3高温アニールのランプ<ol><li>以下のようにプログラムサーマルサイクラー： <ol><li> 5分/℃の割合で60℃まで85℃に上昇します。 </li><li> 75分/℃の割合で4℃まで60℃に上昇します。 </li><li>無期限に4℃で保持します。 </li></ol></li><li>製造後に-20℃で保存するサンプルを終了しました。 </li></ol>過剰ステープルズの4取り外し<ol><li> 100キロダルトンのMWCOと0.5ミリリットル遠心分離フィルターにフォールディング反応混合物の100μLを加えます。後の分析のためにnanorobots予備精製の10μlのサンプルを保存します。 </li><li> 9,600×gで10分間遠心。 </li><li>フォールディングバッファー（1×TAE、10のMgCl 2）400μlのを追加します。 </li><li>繰り返し二回より4.2と4.3を繰り返します。 </li><li>9,600×gで5分間遠心。 </li><li> 9,600×gで1分間きれいなマイクロ遠心チューブやスピンに逆さまにフィルタを配置することによって濃縮物を回復します。最終容積は、フィルタに入れ、製造の反応混合物の初期量に依存して変化し得ます。典型的には、濃縮されたナノロボット試料25-60μlの最終容量を得ました。 </li><li> 260nmで分光光度計を経由して試料中のDNA濃度を測定します。ナノロボットサンプルのモル濃度を算出する際に5.3μgの/ピコモルの分子量を使用してください。 注意：二本鎖DNA、50μgの/ OD 260のためのモル吸光係数を、ほとんどのアプリケーションで十分です。 48μgの/ OD 260は、エッジのステープルの口座に一本鎖DNAが伸びポリチミンを取ります。 </li></ol>二つ折りNanorobotsの5アガロースゲル電気泳動分析<ol><li> 0.5×TBE（45mMのトリス-ホウ酸、1mMのEDTA）を10mMのMgCl 2を補充した2％アガロースゲルの調製</suB&gt;（エルネスト・カストロらから適応21。）： <ol><li> ddH 2 Oの118.75ミリリットルで10倍TBEストック緩衝の6.25ミリリットルを希釈することにより、0.5×TBE緩衝液を準備</li><li> 0.5×TBEバッファーの125ミリリットルで、アガロースの2.5グラムを溶解します。 </li><li>アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで煮。 </li><li> 10mMの最終濃度になるように、1MのMgCl 2の1.25ミリリットルを追加します。 </li><li> 10 mg / mlの臭化エチジウムの7μLを加えます。 </li><li>少しクールを解決するために待って、アガロースゲル固化する前にゲルトレイを埋めます。すぐに目的の櫛をインストールします。 </li><li> ddH 2 Oを 940ミリリットルに10倍のTBEストック緩衝し、1MのMgCl 2の10ミリリットルの50ミリリットルを追加することで、ランニング緩衝液1 Lの0.5倍のTBEを準備</li><li>ゲル電気泳動デバイスにバッファを実行している固体のアドオンで、氷浴中にデバイスを入れたら。 </li></ol></li><li>足場と一緒nanorobots予備精製の負荷1μgの全DNA（ステップ3.2）、および精製後（ステップ4.7）、ゲル上のDNAサンプルと1 kbのDNAマーカー。 例を図2に示す 。試料の実際の体積は、精製後に得られた濃度に依存します。 6、最終体積比：各サンプルは1でローディングバッファーにロードされます。 </li><li> 80 Vに電源​​を設定し、3時間ゲルを実行します。氷と水で満たされた浴中でゲルを実行します。 Nanorobotsは展開し、アガロースゲル電気泳動中に熱くなる場合スメアとして表示されます。電気泳動時の加熱からデバイスを保つために、追加の氷を追加します。 </li><li>紫外線テーブル上のビューゲル（ 図2）。 </li></ol>ウラニルギでナノロボットの6陰性染色<ol><li> 2％のウラニルギストック溶液の調製（カストロらから適応23）： <ol><li> 15ミリリットルチューブにウラニルギ粉末100mgを秤量します。 </li><li> 3分間沸騰のDNase / RNaseを含まない超純水は、脱酸素化物をします。 </li><li>脱酸素したお湯（〜60℃）の5ミリリットルを追加します。（前のステップから）ウラニルギ粉末を含む15mlチューブに。しっかり開閉蓋、10分（渦に締めチューブ）のために厳密にアルミ箔と渦に包みます。溶液は黄色の色で濁って表示されます。 </li><li> 0.2μmシリンジフィルターで濾過してソリューションを提供します。溶液は透明になるはずです。 </li><li>小分けマイクロ遠心チューブに溶液200μl。 </li><li>チューブの底のプールサンプルにテーブルトップ遠心機で5分間最大速度で遠心。 </li></ol></li><li>グリッドとネガティブ染色への試料のローディング： <ol><li> （セクション6.1で調製した）2％ウラニルギ溶液200μlアリコートを解凍。 3分間厳密に0.5 M NaOH溶液と渦の10μLを加えます。テーブルトップ遠心機を用いて5分間、最大速度で遠心。 </li><li>一方、グロー放電グリッド0.2ミリバールと30秒25 mAで部屋の空気を使用して。 </li><li>精製後2 nmのナノロボットサンプルの15μlのを追加（secti4.7の）鉗子で開催されたグリッド（）の上面上に、1分間に吸収させます。ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。 </li><li>すぐにろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用しています。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>繰り返しは6.2.4と6.2.5を繰り返します。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。染色溶液を30秒間吸収しましょう​​。 </li><li>ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>グリッドは、少なくとも30分間完全に乾燥TEMに注入する前に、ろ紙上に直面しよう。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetical+implications+of+the+structure+of+deoxyribonucleic+acid.">Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 171, 964-967 (1953).</li><li>Kosuri, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+de+novo.+DNA+synthesis:+technologies+and+applications.">Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications.</a> Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).</li><li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology.">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).</li><li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+junctions+and+lattices.">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li><li>Chen, J. H., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+from+DNA+of+a+molecule+with+the+connectivity+of+a+cube.">Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube.</a> Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).</li><li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+shapes+self-assembled+from+single-stranded+DNA+tiles.">Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+DNA+nanotechnology:+state+of+the+art+and+future+perspective.">Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective.</a> J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> J Vis Exp. (77), e50268 (2013).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+from+cell-based+selection+for+bioanalytical+applications.">Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications.</a> Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamer-Guided+Cancer+Therapeutics+and+Diagnostics:+The+Next+Generation+of+Cancer+Medicine.">Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine.</a> Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).</li><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions.">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).</li><li>Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+aptamers+for+recognition+of+virus-infected+cells.">Generating aptamers for recognition of virus-infected cells.</a> Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).</li><li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX.">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li><li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+for+Small+Molecule+Aptamer+Development.">Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development.</a> J Nucleic Acids. 2012, (2012).</li><li>Amir, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+computing+by+DNA+origami+robots+in+a+living+animal.">Universal computing by DNA origami robots in a living animal.</a> Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).</li><li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+folding+of+DNA+into+nanoscale+shapes+at+constant+temperature.">Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature.</a> Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li><li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています、15,22。 説明した製造プロトコルは、...

核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ2の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション3およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。 足場のDNA折り紙9技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 ​​な2D / 3Dナノアーキテクチャ10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 ​​な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno 13などのCADツールの開発を可能にしました。 これまで我々はcaDNAnoツール14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡（TEM）を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor 16,17またはDNAの鎖置換技術18のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。 初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団15内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。 ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラスら 15によって示さanorobot製造プロセス。

<table><tbody><tr><td>DNase/RNase free distilled water</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA scaffold</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 10&amp;nbsp;mg/ml solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA marker</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>uranyl formate</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>carbon-coated TEM grids&amp;nbsp;</td><td>Science services</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler c1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge K100X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV table Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>Tecnai</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動（AGE）を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡（TEM）により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。

代表的な結果を図2Aに示されています。すべてのレーンは、分光光度計（OD 260）を介して測定し、合計1μgのDNAが含まれています。環状一本鎖DNAの足場（レーン2）と比較して、nanorobotsは、それらのより高い分子量、骨格DNA（レーン3赤矢印）にステープルハイブリダイゼーションの結果をゲルに妨げられます。レーン3中の低分子量バンドは、足場のDNA（緑の矢...

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DNA 折り紙からの生体応答ロボットの折り畳みと特性評価 |化学 |ビデオ

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K ビュー.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

化学

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

生物工学

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

生化学

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

要約

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折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

遺伝子療法ポリカチオンコーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラルプラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

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一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

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単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

遺伝子療法ポリカチオンコーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラルプラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成