1。サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRのアッセイデザインアルゴリズム<ol><li> Solarisの定量PCRプローブ/プライマーペアの設計で使用されるアルゴリズムは、それによって普遍的なサイクリングの条件を可能にする各コンポーネントのTmを調整します。 MGBの定款、または副溝結合、プローブの部分は、Tmを増加させ、より大きなアッセイの柔軟性とパフォーマンスのために設計されるため、より短いプローブすることができます。その名前が示すように、MGBsはDNAのらせんの副溝に収まることができる抗生物質のクラスです。 MGBsは、DNAプローブの3または5の端に添付されます。ソリューションでは、プローブのFAMのレポーターの蛍光は、Eclipseダーククエンチャーによりクエンチされる。プローブが標的配列に結合すると、プローブの3次元立体構造の結果としての変化は、強い蛍光シグナルを可能にします。標的配列のDNAプローブの結合は、PCRのための適切な溶融温度を維持しながら、高度に特異的な、より短いプローブの使用を可能にするMGB、によって安定化される。このように、信号検出は、ターゲットの増幅のアニーリング相の間に発生します。拡張ステップの間、MGBプローブは、関連付けを解除して、蛍光は再び急冷する。プローブがアソシエーションを解除するので、それはPCR効率には影響しません。 </li><li> Solarisのアルゴリズムのもう一つの特徴は、Superbasesの使用です。 Superbasesは、債券ATの安定性を向上させ、GGグアニンに富む配列における自己会合を排除するための結合能力を強化している拠点を変更されます。また、彼らは、5末端に接続された隣接する蛍光物質を消光しない。これらの塩基を選択的に標的配列の可用性を拡張するために、アルゴリズムにしたがって、配置されます。これは、そうでない場合はプライマーとプローブを設計する際に避けられるようなGCリッチな領域として配列が、使用することが可能になります。 </li><li>可能な限り、Solarisのアルゴリズムは、ターゲットサイトのエキソン接合貫通領域を内蔵しています。これは、汚染物質ゲノムDNAの増幅を回避することによって特異性を向上させます。 </li><li>重要なのは、このアルゴリズムは、すべてが単一のプローブ/プライマーセットによってカバーされるような既知のすべてのスプライスバリアントのためのコンセンサス配列を、識別する。そう、唯一のアッセイは、興味のある特定の遺伝子のために必要です。 </li><li>最後に、Solarisの定量PCRアッセイの設計アルゴリズムは、GC含量、長さ、Tm値、および均一なヌクレオチドのストレッチなどの重要な設計上の考慮事項のための非常に厳しいパラメータを利用しています。ゲノム、トランスクリプト、および偽遺伝子：結果のシーケンスは、3つの異なるデータベースを使用して特異性のために分析BLASTです。 </li></ol> 2。 Solarisの試薬の入手方法<ol><li>適切なSolarisの試薬 ​​を入手するには、 <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solarisを</a> </li><li>一度Webサイトで&quot;GENEius商品検索&quot;をクリックしてください。 GENEius製品検索へ直接移動するには、を参照してください<a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li>検索照会ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。 </li><li> GENEius製品の検索は、多くの異なる遺伝子の識別子を処理することができます。ここでは、文献[シーケンシャルアク、遺伝子ID、遺伝子シンボル、遺伝子情報、サンガーのIDまたはアクセッション番号、またはカタログ番号を含む、対象の遺伝子を見つけるために提案された検索用語、のいずれかを入力します。その後、&quot;検索&quot;をクリックしてください。 </li><li>目的の遺伝子を特定し、左側の&quot;選択&quot;をクリックしてください。これは、目的の遺伝子のために利用可能な異なるサーモサイエンティフィックの製品を表示するウィンドウを開きます。 &quot;製品&quot;の下に&quot;定量PCRの検出&quot;タブを選択します。 </li><li>見出しの&quot;Solarisの遺伝子発現アッセイ&quot;の下に、最適にSolarisのプローブ/プライマーアッセイを設計したものが表示されます。このアッセイは、遺伝子のターゲットのすべての既知のスプライシングバリアントをカバーします。希望する数量を選択してください。彼らは、100、200、400で提供され、 1000 X 25μlの反応（アッセイはオーダーメイドとして識別されている場合、100枚サイズは使用できなくなります）。 &quot;カートに入れる&quot;をクリックしてください。 </li><li>次に、使用するサーマルサイクラーに適したマスターミックスを選択します。マスターミックスが可能なマシンで最適に動作するかを決定するために、クリックして&quot;マスターミックスは、PCRのサーマルサイクラーで最適な動作するこちらをご覧ください。&quot; </li><li>使用するミックスを決定するためにメニューに使用される定量PCRのサーマルサイクラーを見つける。 </li><li> GENEius製品の検索ウィンドウに戻り、適切なマスターミックスを選択します。マスターミックスは、100、200、400、および1000反応のサイズがあります。 &quot;カートに入れる&quot;をクリックします。 </li><li>推奨リファレンス遺伝子と裏面cDNA合成キットは、完全な定量RT - PCR分析のために注文することができます。 </li><li> Solarisの定量PCR試薬が到着すると、使用直前まで-20℃で保管します。以下の試薬を受信する必要があります：色曲、800 nMの各、200 nmで提供されて一つの遺伝子特異的プローブで提供されている2つのプライマーを含む20倍ソリューションをプローブとプライマー、および2Xの濃度でのSolaris定量PCR遺伝子発現のマスターミックスの両方のレンス情報。 Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、12ヶ月以上安定しています。融解凍結を避けてください。 </li></ol> 3。定量PCRセットアップ<ol><li> cDNAを定量PCRのプロトコルを開始します。トータルRNAをスピンカラム法を用いて抽出する必要があります。サーモフィッシャーサイエンティヴァーソcDNA合成キットはcDNAを生成するために逆転写することをお勧めします。 </li><li>プライマー、プローブ、およびマスターミックスを氷上で融解することによって定量PCRの準備。また、リアルタイムPCRの感度を向上させることができる手PCRグレードの水と不透明な白の定量PCRプレート、上持っている。 </li><li> 1）サーモスタートDNAポリメラーゼ、Thermoprime DNAポリメラーゼのホットスタートバージョン：マスターミックスには含めてリアルタイムPCR用のすべてのコンポーネントが含まれています。ポリメラーゼのこのタイプは、最大反応、設定し、95℃で15分で活性化工程を必要とする時の非特異的増幅を防ぐために使用されます。 2）SolarisのマスターミックスでのdNTPは、dTTPのは、Solarisのプライマー/プローブアッセイで動作するように最適化された独自の反応緩衝増幅効率3）を、最大化するためにdUTPを置き換えます。この反応バッファー、試薬とプラスチックの間のコントラストを高めるために青色色素が含まれています。あなたの定量PCR装置がROX必要とする場合4）ROX、。 </li><li>ソリューションが融解した後、チューブを（ボルテックスしない）フリックで混ぜる。試薬の損失を防ぐために、それらをスピンダウン。 </li><li>次に、サンプル数に応じてスケールアップ、反応の目的遺伝子の組み合わせに加え、リファレンス遺伝子の1つを設定するために15 mLの滅菌ファルコンチューブを準備する。十分な三人レプリケートするよう準備を標準曲線法は、分析のために使用される場合は、テンプレートのコントロール（NTC）と標準曲線のサンプルを含むため、個々のサンプルを用意することができます。 </li><li> 96ウェルプレート上で実行される各サンプルについて、以下のミックス：最終反応容積こと2XのSolaris定量PCRマスターミックス、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）、およびそのようなPCRグレードの水の0.5μlの5μLを、一度cDNAを25μLとなる追加されます。 384ウェルプレート上で実行される各サンプルに対して次のように混在させる：2XのSolaris定量PCRマスターミックスの12.5μL、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）の1.25μL、およびそのようなPCRグレードの水を最終反応容量、一回のcDNAその10μLとなる追加されます。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用して、プレートの適切なウェルにマスターミックスを転送する。マスターミックスに含まれる青い色素は、白色プレート上にピペットで進捗状況を追跡する際に役立ちます。その後、1-5μLのcDNAテンプレート（96ウェルプレートの場合）またはcDNAテンプレートの1〜2μLを（384ウェルプレート用）を追加。ミックスを上下にピペッティングし。遠心分離機にプレートを置き、これらの蛍光測定値に干渉するので、任意の気泡を除去するためにスピンダウン。 </li><li>プログラムは、サーマルサイクラー：酵素は95℃15分（1サイクル）でアクティブにする必要があります。 95その後40サイクル60℃℃、15秒間の変性、及びアニーリングおよび伸長℃（60秒）。 </li><li>定量PCR機器にプレートを置きます。プログラムを起動します。 </li></ol> Solarisを使用して代表的な定量PCRの結果<img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 PCRの効率とr2の値で判断してSolarisのアッセイは、非常に低い入力濃度で信頼性の高い検出を与える。合成RNAアンプリコン配列またはDNAのアンプリコン配列から合成したcDNAの十10倍希釈液をそれぞれF2RL1またはCDC20、のためのSolaris定量PCRの遺伝子発現アッセイを用いてABI 7900HT楽器で増幅した。対数増幅曲線と標準曲線は、効率性、R2の値は、10 log10の希釈液の外ダイナミックレンジ、および検出の下限値を含む各アッセイの性能と一緒に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 Solarisのアッセイは、さらに別の研究者と研究所間の一貫性のある結果を与える。 ALDOAとPPIBだけでなく、非標的コントロール（NTC）をターゲットにしたsiRNAは、100、10、1、0.1 nMの終濃度でHeLa細胞にトランスフェクションした。細胞を採取し、全RNAは、48時間後の治療を単離した。 cDNAは、サーモフィッシャーサイエンティヴァーcDNA合成キットを用いて合成した。 cDNAのアリコートをロシュクラー480（384）プラットフォーム上でALDOA、PPIB、およびGAPDHの検出のためのSolaris定量PCR遺伝子発現アッセイを使用して、2つの地理的に離れた研究室で増幅した。ノックダウンはΔΔCq法（GAPDHリファレンス遺伝子とNTC処理細胞に規格化）を用いて算出した。ノックダウンの同じレベルは、両方のサイトの両方の研究者との間の遺伝子標的の両方で実証された。

この記事の著者は、サーモサイエンティフィックの従業員です。

サーモサイエンティフィックのSolaris qPCRアッセイは、qPCR解析を実行するための簡単​​な、改良された方法を提供する。 MGB技術とSuperbasesを組み込んだ、高ストのアルゴリズムを使用して、これらプライマーおよびプローブセットは、定量PCR実験の忠実性と堅牢性を最大化する。一のプライマーおよびプローブセットは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを認識する。ターゲットサイト、可能な限りは、ゲノムDNAが増幅されていないことを保証するために、エクソンにまたがる領域を含む。これらの機能は大幅に複雑な実験を実行するために必要な時間の量を減らすこと、同時に多数のサンプルを実行することが可能に。マスターミックスは青なので、ピペッティングのトラックを失うことなく、定量PCRの感度を向上させる白色不透明プレートを、使用することが可能です。 すべて一緒になって、Solarisの定量PCRアッセイのデザインの特徴は、この小説定量PCRアッセイの特定と、堅牢かつシンプルな、まだ高性能なアッセイを行う。

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの感度および精度を維持しながら、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計されたプライマー/プローブセットの新しいタイプです。これらのプライマー/プローブセットは、以前は利用可能な技術からヒトとマウスのゲノムと機能の大幅な改善の&gt; 98％に予め設計されています。これらの改善は、サーモフィッシャーサイエンティバイオインフォマティクスの専門家によって開発された斬新なデザインのアルゴリズム、のおかげで可能にした。 いくつかの便利な機能が定量的リアルタイムPCRを行うのプロセスを合理化するためのSolaris定量PCRアッセイに組み込まれています。最初に、プロトコルは、一般的に用い選択肢に似ていますが、その定量PCR中に使用される方法は精通している可能性があります。第二に、マスターミックスは、追跡するために、定量PCRの反応は、設定を容易になる、青です。第三に、熱サイクル条件は、すべてのアッセイ（遺伝子）、それは可能な限り一度に多くのサンプルを実行することやエラーの可能性を減少させるための同じです。最後に、プローブとプライマーの配列情報は、公開プロセスを簡素化、提供されています。 ここでは、ご注文のウェブサイト（www.thermo.com / Solaris）上で、どのように標準曲線法を用いてqPCRを行うためのSolarisの試薬を使用するために見つけたGENEius製品検索機能を使用して適切なSolarisの試薬を取得する方法を示します。

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの特異性と堅牢性を犠牲にすることなく、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計された斬新なデザイン済みの定量PCRプライマー/プローブの組み合わせです。

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K ビュー.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

ビデオ: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

がん研究

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

環境学

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

医学

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

免疫・感染学

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

生物学

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

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標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

ポータブルリアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

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標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

ポータブルリアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出