イオン交換クロマトグラフィー

ソース: 研究所博士 b. ジル Venton - ヴァージニアの大学の

イオン交換クロマトグラフィーは、分離電荷に基づく分析クロマトグラフィーのタイプです。イオン交換樹脂と呼ばれる強固な支援に荷電固定相で満ちている列が使用されます。強陽イオン交換クロマトグラフィーを優先的に強い陰イオン交換クロマトグラフィーを優先的に陰イオンを荷電の樹脂を使用して選択する中に負荷電の樹脂を使用して陽イオンを分離します。クロマトグラフィーのこのタイプは、タンパク質や核酸のサンプルのクリーンアップでたとえば、サンプル準備のため人気があります。

イオン交換クロマトグラフィーは、2 段階のプロセスです。最初のステップでは、サンプルが読み込みバッファーの列に読み込まれます。列樹脂有償サンプルのバインドは、電荷が逆のサンプルを引き付けるために樹脂のイオン相互作用に基づいています。したがって、樹脂に逆極性の電荷サンプル強くバインドされます。満たされないまたは反対の電荷の他の分子はバインドされず、列を洗っています。2 番目のステップは、樹脂にバインドされている検体を溶出することです。これは、塩のグラデーション、バッファー中の塩の量が徐々 に増加しています。分数は、溶出が発生し、これらの画分のいずれかで関心の精製サンプルを回復できるよう、列の最後に収集されます。分光学、といった別のテクニックは、どの分画にはサンプルが含まれていますを識別するために必要かもしれない。イオン交換クロマトグラフィーは、蛋白質の調査のサイズは樹脂との相互作用の数を確認できます、特定の請求またはサイズを持つ興味の蛋白質を分離するのに便利です。

イオン交換クロマトグラフィーは、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーもしばしば抗体が 1 つの特定の試料をバインドする列にアタッチされている蛋白質のサンプルの準備で使用されているよりもより一般的な分離手法です。同じ料金の多くの蛋白質をクリーンアップするイオン交換カラム、頻繁に異なる溶出条件の同じ型を使用できますが、新しいアフィニ ティー ・ カラムは各試料の購入されなければなりません。イオン交換クロマトグラフィーは、分離の他のプロパティに基づくクロマトグラフィーの他のタイプと組み合わせても使用できます。たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー分離サイズに基づいて、イオン交換クロマトグラフィーの前にだけ与えられたサイズの化合物を選択される可能性があります。

イオン交換クロマトグラフィーの固定相試料の可逆的吸収につながるイオンの化学的相互作用の原則が適用されます。サンプルと固体のサポートの間の絆の強さは、数とサンプルと樹脂の官能基の種類によって決まります。読み込みバッファー サンプルと樹脂との間の相互作用を促進するために低伝導率を通常されます。弱陽イオン交換樹脂はカルボン酸を持っている間、強い陽イオン交換樹脂は通常スルホン酸官能基を備えています。強い陰イオン交換樹脂には、弱陰イオン交換樹脂機能二次または第三アミン、第四紀のアミンが含まれています。強くて弱い条件は列材料と方法でなくそれは検体を結合の酸/塩基特性を参照してください。弱い樹脂強い樹脂よりも小さい pH 範囲で起訴はまだ非常に効果的に、検体をバインド、彼らは必要な pH 範囲で充電されている場合良い選択になる可能性があります。使用前にイオン交換カラムは平衡バッファーを使用して ph 平衡です。

目的の標本を溶出するには、塩の勾配が使用されます。塩がイオン結合列を乱す最も簡単より少なく密、樹脂にバインドされているサンプルの溶出が最初に。緊密にバインドされますサンプル溶出後、塩の多量を使用する場合。通常、塩の線形グラデーションを使用塩濃度が直線的に時間の経過と共に増加します。ただし、ステップのグラデーションも使用できます時間をかけて塩の濃度は、ステップ アップ。

イオン交換実験のための 1 つの重要な考慮事項は、バッファーの pH です。PH は興味の analyte が充電され、樹脂にバインド、維持される必要があります。タンパク質の電荷はタンパク質が中立的充電し測定として pI をタンパク質の等電点に基づいています。タンパク質の pI と比較して pH は、予想される蛋白質充満についてを説明します。陽イオン交換クロマトグラフィー、pH を上げも少ない正荷電とやり取りする可能性が低くマイナスに帯電樹脂に analyte が発生します。同様に、陰イオン交換クロマトグラフィーにおける、pH を下げると、少ない負荷電と荷電樹脂と対話しにくくする検体が原因となります。したがって pH 調整は列から検体を選択的に溶出するも使用できます。塩ではなく pH 調整の使用は別の pI 値を持つ 2 つの異なる種類のタンパク質を分離するために有利な可能性があります。

1. サンプルと列を準備します。

1. このデモで 2 つのタンパク質の混合物を陽イオン交換カラムで分離されます: ヘモグロビンやチトクロム c. 追加 0.2 mL 平衡バッファー (pH 8.1) 蛋白質のサンプルし、徹底的にミックスする渦。任意の泡を削除に 2 分間遠心します。
2. レジンの解決を許可するように 5 分間テスト チューブに陽イオン交換カラムを配置します。それは直立させるリング スタンドに列を持つテスト チューブをクランプします。
3. 列のトップ キャップ、ボトム キャップを開きます。試験管に重力を点滴する列のバッファーを許可します。
4. 洗って二度と列列のボリューム (この場合は列ボリュームは 0.3 mL) 平衡バッファーの。廃棄物のバイアルにうち平衡バッファー点滴の 2 番目の列ボリュームを追加する前に最初の列ボリューム (0.3 mL) をみましょう。この手順では、平衡の平衡バッファーで列をことができます。樹脂を邪魔しないようにこの手順でゆっくりと平衡バッファーを追加します。

2. 陽イオン交換カラムによる蛋白質のサンプルの実行

1. 「非連結 1] というラベルの付いた 2 mL 遠心管中列を置きます。列の一番上に蛋白質のサンプルの 0.1 mL を慎重にロードします。
2. サンプルは、列の上部に搭載されている、一度、0.3 ml の平衡バッファーの列の上部にバッファーを追加し、すべての方法を介して滴下することができます洗います。(5 洗浄の合計) の 4 倍を繰り返し、独立した 2 mL の遠心管で各洗浄を収集します。「1-5 非連結」としてチューブ ラベルを付けます。
3. 10 遠心分離機の最後 2 の洗浄のため列をすべての非連結の種を確実にする 1,000 x g で s。列にバインドされるサンプルはこれらの洗浄は、いけませんが、バインドされないサンプルは unretained を洗浄します。遠心分離列からバインドされていない材料を洗浄するより多くの力を提供します。
4. 「バインド 1」というラベルの付いた新しい 2 mL 遠心コレクション管中列を置きます。上列 0.3 mL の溶出バッファー (高い塩、pH 5.5) を置きます。10 結果の溶離液を遠心分離機 1,000 x g で s。
5. 回 0.3 mL を追加する新しい遠心管に列を配置することによって溶出のステップ 2 を繰り返し、これら 10 s. ラベルの遠心分離」は、2 と 3 をバインドされて」。
6. 色の変更や、分数についての観察を記録します。ヘモグロビン、シトクロム C は赤味がかった色、赤茶色に見える色蛋白質であります。

ヘモグロビンやチトクロム C の結果: 陽イオン交換

1. シトクローム C は 10.5 とヘモグロビン 6.8 の pI pI です。したがって、pH 8.1 平衡バッファーを使用すると、ヘモグロビンが列にバインドできません、それが負荷電であるので。チトクローム C この ph 条件で積極的に充電、ために、列にバインドは、pH < pI。
2. ヘモグロビンは、列にバインドされていないために、非連結の分数で観察されます。
3. シトクローム C は、陽イオン交換カラムにバインドされたため、バインドされた分数で観察されます。

図 1。非連結の分数 (ヘモグロビン) とバインドされている割合 (シトクロム C) の画像。

イオン交換クロマトグラフィーは、分離し、蛋白質のサンプルを浄化する生化学で使用されています。蛋白質はあるベビーベッド利用の官能基を持つ多くのアミノ酸です。タンパク質は pH に依存している純充満に基づいて区切られます。いくつかのタンパク質は、一方、他の人はより負荷電にもっと積極的に追加料金です。さらに、ペプチドのタグが、遺伝的にみるはない通常蛋白質の範囲のことを完全に分離することが可能の等電ポイント蛋白質に追加できます。イオン交換クロマトグラフィーは、電荷とさまざまな相互作用の量が異なるがある異なる構成ポリコームタンパク質複合体を分割するのに役立ちます。

イオン交換クロマトグラフィーのもう一つの主要なアプリケーションは、水分析です。陰イオン交換クロマトグラフィーは、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、フッ化物、および塩化物を含む陰イオンの濃度の測定に使用できます。陽イオン交換クロマトグラフィーは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの陽イオンの濃度を測定するために使用されます。イオン交換クロマトグラフィーの種類はまた、水の浄化、バインドされたナトリウムを解放する樹脂にそれらをバインドすることにより硬水のマグネシウム及びカルシウム イオンをほとんど軟水フィルターで使用されます。銅や鉛などの重金属は、イオン交換クロマトグラフィーを用いた水からも削除することができます。

イオン交換クロマトグラフィーは、金属精製に便利ですも。Actanides、プルトニウムなどを浄化し、原子炉の使用済み燃料棒から削除する使用できます。それは、ウランを清掃し、水やその他の環境試料から削除する使用できます。