無菌マウスへのヒト糞便移植のためのBioexclusion IsoPositive Cage実験の調製と維持

このプロトコルは、無菌状態を維持しながら、実験用シングルケージアイソレーター(isocages)に無菌マウスを移し、収容するためのベストプラクティスを説明しています。無菌マウスへの糞便移植の方法と、これらの腸内「ヒト化」マウスからの生存可能な細菌の収集について、さらなる応用のために説明します。

無菌マウスは、宿主の健康と疾患における微生物の寄与を理解するための重要な調査ツールであり、宿主応答における微生物の個人、定義された、または複雑なグループの特定の役割の評価を可能にします。従来、軟質フィルムまたは半硬質のアイソレーターで飼育されてきた無菌マウスの飼育と実験的な操作には費用がかかり、多数の訓練を受けたスタッフと動物飼育施設の広いスペースフットプリントが必要です。IsoPositiveケージシステムは、個々の密閉された陽圧アイソレーターケージ(isocages)で無菌マウスの実験的操作を可能にし、コストを削減し、実験操作の柔軟性を高めることができます。

ここでは、無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移し、その後、ヒトドナー便からマウスに糞便を移して、将来の研究のために安定した長期腸の「ヒト化」マウスを作成するためのプロトコルについて説明します。イソケージシステムの利用に必要な材料と準備が説明されており、ケージ、消耗品、機器、および個人用保護具を洗浄するための二酸化塩素滅菌剤化学滅菌剤の使用が含まれます。移植したマウスの無菌状態を確認する方法と、ケージシステム内の汚染を判断する方法について説明します。寝具、食料、給水などの飼育手順についてさらに説明します。ヒトの糞便スラリーの調製と無菌マウスへの強制経口投与による腸内「ヒト化」マウスの作成、およびこれらのマウスの微生物群集組成を監視するための糞便収集のプロトコルについて説明します。ある実験では、ヒト糞便移植後2週間で、マウス宿主におけるドナー微生物叢の安定したコロニー形成が可能になり、その後の実験利用が可能になることが示されている。さらに、生存率保存培地中のヒト化マウス糞便の収集が記載されており、さらなる機能実験での使用が可能になる。全体として、これらの方法は、さらなる操作のために、実験的なノトバイオティクスケージにヒト化マウスコミュニティを安全かつ効果的に確立することを可能にします。

無菌マウスは、マイクロバイオーム研究者のレパートリーに欠かせないツールであり、宿主の健康状態や疾患状態における微生物叢の寄与を分析することができます。無菌マウスは完全に無菌で生まれ、生涯にわたって無菌のままです¹.無菌マウスに特定の細菌株をコロニー形成することで、これらの分類群と代謝、免疫、またはその他の宿主機能との間の原因研究が可能になります2,3,4,5。特に有利なのは、ヒトのドナーから得られた糞便を移植することにより、無菌マウスを微生物叢のレベルで「ヒト化」する能力であり、バリア条件で飼育すると、マウス由来の微生物からの汚染を防ぐことができる^1。このアプローチにより、マイクロバイオームの分野で多くの重要な発見、例えば、ヒトの腸内細菌叢ががん免疫^{療法の反応}に及ぼす影響など、多くの重要な発見が可能になりました^6,7,8。

しかし、ヒト化無菌マウスはマイクロバイオーム分野の研究努力にとって非常に貴重ですが、このアプローチの広範な適応を阻害する多くの制限があります。無菌マウスは、セミリジッドまたはフレキシブルフィルムの大型アイソレーターで飼育および維持されますが、機能実験では、1つのミニアイソレーターに複数のケージを収容する個別のミニアイソレーターをセットアップする必要がありますが、これは1つの実験条件下でのみ可能です。このミニアイソレータアプローチは、スペースフットプリントとコストを増加させると同時に、実験で調査できる実験条件の数と並行して実行できる実験の数を大幅に制限します。有望な解決策は、ISOcage P Bioexclusion System(ここではisocageシステムと呼ぶ)^9,10と呼ばれる個別のモジュール式ケージシステムを使用することです。アイソケージシステムは、個々の密閉された陽圧アイソレーターケージ内で無菌マウスの実験的操作を可能にし、各ミニアイソレーター間ではなく、各ケージ間で別々の実験条件を可能にします。適切な無菌技術により、動物を無菌条件下で最大12週間アイソケージに収容したり、ヒト糞便移植によってヒト化して、互換性のある実験的アプローチ(つまり、無菌条件下で実施可能)で使用することができる。アイソケージシステムを使用して複数の独立した実験を並行して実行でき、ミニアイソレータ間で複数の実験を実行するよりもスペースフットプリントとコストが大幅に削減されます。

無菌マウスをフレキシブルフィルム育種アイソレータで繁殖させる目的は、無菌状態を注意深く保存すること^である11。無菌状態のモニタリングに使用される技術には、マウスの体表面と口腔の定期的な綿棒、および糞便サンプルの無菌収集が含まれ、これらはPCRベースの商用アッセイによって培養およびテストされます。これらのサンプルの細菌学的、血清学的、および真菌学的検査はすべて、無菌状態を決定するために必要です¹¹。無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移して実験用に使用する場合、マウスは綿棒で拭き取り、移植時に無菌状態を確認するために試験されます。イソケージの無菌性チェックは、糞便サンプルの無菌収集を通じて実施され、その後、細菌、ウイルス、および真菌の汚染物質を検出するために培養されます。これらのマウスの無菌状態を検証するには、出生から実験プロトコルの終了まで、これらの無菌チェックの結果を注意深く収集して記録する必要があります。

アイソケージシステムは、個々のケージ(図1)、繁殖アイソレーターから輸送するためのトランスファーディスク(図1)、およびケージを収容するアイソケージラック(図2)で構成されています。各アイソケージには、給気口に取り付けられたケージレベルの高効率微粒子空気(HEPA)フィルターと、閉じたときに気密シールを作るシリコンガスケットが含まれており、汚染物質が空気を介してケージに侵入しないようにします(図1A)。このケージの蓋は、滅菌されたバイオセーフティキャビネット内に逆さまに置くと、滅菌作業面として使用できます(図1A)。ケージ内のワイヤーラックには、フードボトルとウォーターボトルが収納されています(図1B)。ケージ内でオートクレーブ滅菌された鉗子は、ケージ内部の表面との接触を必要とするすべての操作に使用されます。ケージ自体には、外側の動物を識別するための取り外し可能なケージカードホルダー用のノッチと、アイソケージラックにドッキングする吸気ノズルとエクスポートノズルがあります(図1C-E)。安全な閉鎖クランプと蓋のタブロックにより、ラックシステムに再度ドッキングする準備ができたときにケージが密閉されます(図1F)。推奨される寝具はAlpha-driであり、オートクレーブ可能な濃縮小屋も推奨されます(図1F)。トランスファーディスクは、無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移動するために使用され、動物の操作を可能にするために三角形の開口部を備えた回転可能なコンパートメント蓋が含まれています(図1G-H)。ディスクには、小さいサイズ(直径21.6cm)と大きいサイズ(直径28cm)があり、どちらもマウス8匹の容量があります。オートクレーブテープは、ディスクの円周と空気穴に気密シールを作成するために使用され、滅菌剤を浸して滅菌剤を浸した袋で輸送する前に行われます(図1I)。ラックシステム自体には、エアブロワ、ラックレベルのHEPAフィルタステータス、およびラックの非常用バッテリ電源を監視する画面があり、これらはすべてシステムに含まれています(図2A)。密閉されたマグネヘリックゲージは、ケージシステムによって維持される正圧を表示し、自動視覚的なドッキングインジケータはケージのドッキングステータスを示します(黄色のタブアウトは、ケージがドッキングされていないか、ドッキングが失敗したことを意味します)(図2B-D)。また、イソケージの操作には、標準認定のバイオセーフティキャビネットが必要です。

ここで提示するプロトコルは、無菌状態を維持しながら、無菌状態下で無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに成功裏に移送するための適切な方法、ヒトドナー糞便スラリーによる無菌マウスのヒト化、および無菌状態の確認またはさらなる機能研究のための生存能力保存のためのアイソケージに収容されたマウスからの糞便の収集を説明しています。この例では、無菌マウスを、肺がんの免疫療法で治療したヒト被験者のプールされた糞便検体でヒト化し、治療に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして二分化します。この例では、免疫療法反応に対する反応表現型は、腸内細菌叢のヒト化によってレシピエントマウスに移され、その後、レシピエントマウスに腫瘍細胞をさらに接種して免疫療法で治療することができました。人間の糞便スラリーのプロトコルは、研究者が望む任意のヒトドナーの糞便または任意の疾患の前臨床モデルに容易に適応することができます。このプロトコルを使用すると、任意のヒト糞便ドナー微生物叢を無菌宿主に移植することが可能であり、健康と疾患における微生物叢の役割をさらに調査することができます。

図1:アイソケージディスクとトランスファーディスクの概略図(A)ケージ蓋の下面の上面図、内部ケージレベルのHEPAフィルターとシリコンガスケットシールの位置を示すラベル。(B)ケージの内部を上から見た図で、ワイヤーバーの蓋、内部のウォーターボトル、注ぎ口、およびオートクレーブ可能なチャウを保持するためのワイヤーラック内の位置を示すラベルが付いています。(C)ケージカードホルダーのノッチを示すケージの正面図。(D)蓋が上にあるフルケージの上から見た図で、HEPAフィルターがエアインテークノズルにどのように取り付けられているかを示しています。(E). アイソケージラックシステムにドッキングする吸気ノズルとエクスポートノズルを示すケージの背面図。(F)蓋が上にあるフルケージの側面図で、開いた位置にある安全なクロージャークランプを示すラベルがあり、各クランプに白いタブがそれらを所定の位置にロックします。ケージの内部には、底にAlpha-driの寝具が重ねられており、寝具の中に置かれたエンリッチメント小屋が示唆されています。(G)上部に蓋をしたトランスファーディスクの上から見た図。(H)トランスファーディスクの内部を上から見た図で、動物の操作を可能にする三角形の開口部を備えた回転可能なコンパートメント蓋を示しています。(I)完全に組み立てられたトランスファーディスクの側面図は、繁殖アイソレーターからアイソケージへのトランスファー中に気密シールを作成するオートクレーブテープの配置を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アイソケージラックシステムの概略図(A)ケージがドッキングされ、エアブロワーの状態、HEPAフィルターの状態、および非常用バッテリーの監視画面を示すラベルを備えた完全なアイソケージラック。ラックの左下には、ラックレベルの HEPA フィルター用のスロットがあります。(B)ラックによって維持される正圧を示す同封のマグネヘリックゲージ。(C)目に見える黄色のドッキングインジケータがないドッキングされたアイソケージで、ラックとエアノズルの間の接続が成功したことを示しています。(D)ラック内の空のスロットで、ラックが所定の位置になく、エアノズルがアイソケージに接続されていないことを示す目に見える自動視覚的なドッキングインジケーターがあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

すべての動物実験は、フロリダ大学(UF)の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、UF動物管理施設(IACUCプロトコル #IACUC202300000005)で実施されました。無菌野生型(GF WT;C57BL/6)マウスは、UF Animal Care Services Germ-free Divisionによってアイソレーターで飼育および維持されました。雌雄混合のGF WTマウスを繁殖アイソレーターから移し、ISOcage Pバイオエクスクルージョンシステムに配置して、微生物の操作を可能にしました。

ヒトの糞便サンプルは、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)治療を受けた患者から縦方向の便サンプルを採取した前向き観察研究から得られた¹²。インフォームドコンセントは、Advarra IRB による研究承認後に患者から得られました (MCC#18611、Pro00017235)。被験者は、機能研究のための細菌の生存率を維持することを目的とした液体歯科輸送培地(LDTM)便収集キットを受け取り、完成させました。応答評価では、n=4 サンプルをレスポンダー (R) と、n=6 をノンレスポンダー (NR) として特徴付けました。均質化されたLDTMで保存された患者サンプルを個別に解凍し、それぞれを嫌気性チャンバーに90秒以内で入れ、応答表現型(R:n = 4、NR:n = 6)ごとにプールしました。次に、プールしたサンプルを分注し、このプロトコールで使用するために-80°Cで凍結しました。ドナー糞便の嫌気性コロニー形成単位(CFU)数を決定するために、各被験者の糞便を1 × ^10-5 に段階希釈し、各希釈液の10μLを嫌気性脳心臓注入(BHI)およびルリアベルタニ(LB)寒天プレートに二重に播種し、便1グラムあたりのCFU数を推定しました。各被験者からの等しいCFUを糞便接種サンプルにプールして、マウスに強制しました。

1. ケージとオートクレーブの準備

1. アイソケージの準備
   1. ケージに~500mLの2018SXダイエットまたは任意の強化オートクレーブダイエットをプレフィルし、底にALPHA-dri寝具を重ねます。オートクレーブ可能なエンリッチメントハットをケージベッドに置きます。空の密封されていないウォーターボトルとノズル、および長い幅広の先端の鉗子をワイヤーラックの上に置きます。
   2. オートクレーブサイクルごとに1つのケージ内にデュアルスピーシーズ生物学的インジケーターを食品に入れます。各ケージの外側にケミカルインテグレーターストリップを置きます。
   3. ケージを真空サイクルで121°C、最低15PSIで45分間オートクレーブし、その後30分間乾燥させます。国際標準化機構(ISO)の除染ラックを使用してケージを滅菌し、ケージを密閉し、蒸気を内部のHEPAフィルターに通すことで、ケージが開くまで無菌環境を維持します。
   4. 1 Lのボトルに飲料水を入れ、ゴム製のキャップで密封し、ボトルの表面にケミカルインテグレーターストリップを置きます。121°C、最低15PSIで45分間オートクレーブ処理し、液体用の低速排気プログラムを使用します。
   5. 各ケージに取り付けられたケミカルインテグレーターを目視で確認し、適切なオートクレーブパラメータをすぐに確認することができます。
      注:生物学的インジケーターは、無菌条件下でイソケージを最初に開いたときに取り外す必要があります。生物学的インジケーターを37°Cで24時間インキュベートし、色の変化を観察します。元の青/紫の透明な溶液から黄色または濁った液体への鮮やかな色の変化は、微生物の増殖が存在することを示しています。インジケーターが透明で青/紫色のままであれば、これはそのオートクレーブサイクルにおけるケージ内部の完全な無菌性の確認です。

2.二酸化塩素滅菌剤製剤

注意:二酸化塩素滅菌剤は、一度活性化すると非常に腐食性があります。活性塩素 - 二酸化物滅菌剤は、活性剤と塩基との混合から24時間で期限切れになります。二酸化塩素滅菌剤は煙を発生させ、粘膜表面を刺激し、皮膚と接触すると刺激を引き起こす可能性があります。滅菌剤調製用の部屋がシンクと適切な換気にアクセスできることを確認してください。二酸化塩素滅菌剤を使用するときは、安全ゴーグル、人工呼吸器、耐薬品性手袋を着用し、動物収容施設に必要な個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. ミキシングベースとアクティベーター
   1. 標準的な6 Lの容量の二酸化塩素滅菌剤を作るには、まず1 Lのメスシリンダーで1 Lの二酸化塩素滅菌剤ベースを測定し、20 Lの容量のダンクタンクに注ぎます。
   2. 同じメスシリンダーを使用して、4Lの水道水を測定し、ダンクタンクに注ぎます。
   3. ベースと水に使用したメスシリンダーを取っておきます。新しいメスシリンダーを使用して、1 Lの二酸化塩素滅菌活性剤を測定し、ダンクタンクに注ぎます。
   4. アクティベーターをタンクに追加したら、メスシリンダーを使用してタンクの内容物を混合します。
2. アクティベーション
   1. 蓋をダンクタンクに置き、アクティベーターが追加された日時とそれを準備したスタッフの名前を添えて、二酸化塩素滅菌剤としてラベルを付けます。必要に応じて、滅菌剤を混合するために使用されるメスシリンダーを使用して、1Lをスプレーボトルに移すことができます。
   2. ダンクタンクとスプレーボトルをイソケージラックとケージがある動物飼育室に移動します。活性塩素二酸化物滅菌剤は、完全な活性化を確実にするために、使用前に少なくとも20分間放置する必要があります。
      注:大量のケージ(>9)を操作する場合、ダンクタンクに一度に最大12Lを準備できます。1ケージを操作するため、または緊急時には、1.2Lの二酸化塩素滅菌剤を小さな容器に調製し、2つの1Lスプレーボトルに移すことができます。滅菌剤は、無菌マウスの予想される移植の少なくとも1時間前に調製することをお勧めします。.

3.滅菌

1. ドンPPE
   1. 主要なケージマニピュレーターとして、安全ゴーグル、人工呼吸器、耐薬品性手袋、滅菌手術用ガウン、ブーファント、スリーブカバー、シューズカバーを着用してください。PPEの下にスクラブを着用すると、生地が二酸化塩素滅菌剤と接触すると、広範囲にわたる汚れが発生します。
   2. プライマリケージマニピュレータのアシスタントをお勧めします。アシスタントにプライマリケージマニピュレーターと同じPPEを着用してもらいますが、非滅菌の手術用ガウンを着用する場合もあります。
2. バイオセーフティキャビネットの準備
   1. 10枚のワイプを二酸化塩素滅菌ダンクタンクに入れ、完全に浸されていることを確認します。
   2. 浸したワイプをバイオセーフティキャビネットに移動し、キャビネットのすべての表面を後ろから前に向かって、平らな作業面、左側、フードの背面、右側、前面の内部ガラスの順に浸します。バイオセーフティキャビネットの保護されていない表面に触れずにワイプを絞ることにより、これらの表面を非接触で浸漬します。
   3. 1回のクリーニングの後、ワイプを二酸化塩素滅菌ダンクタンクに戻し、浸します。
3. アイソケージの準備
   1. メスシリンダーを使用して少なくとも100mLの二酸化塩素滅菌剤を充填して大きなビニール袋を準備し、バッグを振ってすべての内部表面が浸されていることを確認します。バッグを平らな面に置きます。
   2. ラックから1つのアイソケージを取り外し、二酸化塩素滅菌ダンクタンクに入れて、ケージのすべての表面が液体と接触するようにします。タンクに浸したワイプを使用してケージの表面をさらにこすり洗いし、液体が完全に接触するようにします。
   3. ケージを浸した後、アシスタントに濡れたビニール袋を開けてもらいます。ケージを袋に入れ、すぐにアシスタントに開口部を閉めてもらいます。スプレーボトルを使用して、バッグの開口部に二酸化塩素滅菌剤をスプレーします。使用するすべてのケージについて、次の手順に従います。最大4つのケージを1つの36インチ32インチ48インチバッグに収めることができます。
   4. 必要な数の滅菌済み1Lウォーターボトル(1ケージに2Lの水)を二酸化塩素滅菌ダンクタンクに浸し、それらを別の浸したビニール袋に入れます。すべての消耗品がバッグに入れられたら、バッグを閉じ、スプレーボトルを使用してバッグの開口部に二酸化塩素滅菌剤をスプレーします。
   5. すべてのケージと消耗品が袋詰めされたら、耐薬品性手袋を二酸化塩素滅菌剤に浸します(手袋の開口部に届かないようにできるだけ上まで)。
4. 20分の滅菌期間
   1. 完全な滅菌には、最低20分の液体接触時間が必要です。最後のアイテムが滅菌され、プラスチックの浸漬バッグが閉じられたらすぐに、アシスタントに20分のタイマーを設定してもらいます。タイマーの開始後、耐薬品性手袋が二酸化塩素滅菌剤に浸されていない表面に触れないようにしてください。
   2. バイオセーフティキャビネットの滅菌プロセス(ステップ3.2)を繰り返し実行し、タイマーが20分が経過したことを示します。
   3. アシスタントに、浸したビニール袋の外面を頻繁に振って、ケージとボトルの表面に液体が一貫して接触するようにします。
   4. 20分経過後、アシスタントに濡れたビニール袋を開けてもらい、袋の外面だけに触れるように注意しながら、滅菌されたケージと水筒を見せます。
   5. 滅菌された耐薬品性手袋を使用して、各ケージとボトルを滅菌されたバイオセーフティキャビネットに移動します。バイオセーフティキャビネットに収まらないケージが多すぎる場合は、ビニール袋の開口部を閉じ、各開口部の間に二酸化塩素滅菌剤を浸している限り、残りのケージは無菌状態のままであるため、ビニール袋に入れたままにしてください。

4.無菌マウス移植

1. アイソケージの準備
   1. 密閉されたアイソケージを開くには、蓋の側面にある2つのクランプの白いタブを持ち上げてから、各クランプを横に引き出します。蓋をケージから持ち上げるためには、蓋がケージの底部から離れている必要があります。蓋を逆さまにしてケージの左側に置き、これを滅菌ワークステーションとして使用します。
      注:ケージの蓋やオートクレーブ滅菌された器具バッグの内部を滅菌作業面として使用する代わりに、オートクレーブ滅菌されたドレープを利用することで、表面積が広くなり、エラーが発生した場合にケージの蓋が意図せずに汚染されるのを防ぐことができます。
   2. ワイヤーラック上部のケージ内にある滅菌鉗子を使用して、空のウォーターボトルを取り外し、蓋の内側にセットします。ゴムパッキンを取り外して1Lのウォーターボトルを開け、ウォーターボトルに水を注いで満たします。鉗子を使用してノズルをウォーターボトルに置き、しっかりと押し下げてシールします。
   3. 滅菌鉗子を使用してワイヤーラックを持ち上げ、ケージの底に開口部を空けるために数インチ戻します。滅菌鉗子をワイヤーラックに置き、ハンドルがケージの表面に接触しないようにします。
2. 転送ディスクの使用
   注:訓練を受けた無菌スタッフが、繁殖アイソレーターのケアとメンテナンスを担当しています。繁殖アイソレーターの開設に伴うリスクを考慮して、これらのスタッフは、アイソレーターからアイソケージへの無菌マウスのトランスファーディスク滅菌、調製、および移し替えを行います。プロセスを簡単に説明すると、トランスファーディスクはオートクレーブ可能なシリンダーに準備され、滅菌が可能になります。生物学的指標は、それらの無菌性を検証するために使用されます。トランスファーディスクをシールするためのテープもシリンダー内でオートクレーブ滅菌されています。これらの材料を封入した滅菌シリンダーをトランスファースリーブを介してアイソレーターに取り付け、マウスをケージからディスクに移動します。次に、蓋をディスクに置き、オートクレーブテープを使用してディスクの周囲と空気穴に気密シールを作成します。密閉されたディスクは、すぐにアイソレータの出口ポートに配置されます。次に、家庭用アイソレータのポートキャップを閉じ、ディスクの外側を滅菌剤で完全に綿棒で拭き取り、滅菌剤を浸したバッグに入れ、完全な除染を確保するために20分間監視します。その後、無菌育種スタッフがこれらのディスクを研究スタッフに届けます。マウスは、転写ディスクが密閉されてから30分を超えて密封されたディスクに保持することができないため、このプロトコルのすべての前のステップが、転送ディスクが到着する前に十分な時間で完了していることが不可欠です。
   1. トランスファーディスクを受け取ったら、アシスタントにプラスチックカバーを持って部分的に広げてもらい、トランスファーディスクの浸漬面が露出し、アシスタントが触れないようにします。
   2. トランスファーディスクを受け取ったら、アシスタントにプラスチックカバーを持って部分的に広げてもらい、トランスファーディスクの浸漬面が露出し、アシスタントが触れないようにします。
   3. 二酸化塩素滅菌剤に浸した耐薬品性手袋を着用し、滅菌剤に浸していない表面に触れないように注意しながら、プラスチック包装から転写ディスクを取り出します。次に、滅菌したバイオセーフティキャビネットの平らな面にトランスファーディスクを置きます。
   4. 転写ディスクを開くには、テープをはがし、ディスクの周囲を密封し、バイオセーフティキャビネットの外に廃棄します。トランスファーディスクの蓋を取り外し、バイオセーフティキャビネットの外に捨てます。
   5. トランスファーディスクの内側には、開口部が1つしかない回転式コンパートメントの蓋があります。ケージのワイヤーラックにあらかじめ置かれていた滅菌鉗子を使用して、このコンパートメントの蓋を操作し、移動に必要なマウスへの開口部を移動します。
3. ディスクからアイソケージへのマウスの転送
   1. 鉗子を使用して、プラスチック製のディスクカバーの開口部からマウスの尾の付け根をつかみ、ワイヤーラックとケージの間に前に開いたスペースからマウスを持ち上げてアイソケージに移します。そのケージに向けられたすべてのマウスについて繰り返します。
   2. すべてのマウスをそのアイソケージに移したら、鉗子を使用してワイヤーラックを交換します。次に、ケージの蓋を持ち上げ、鉗子を使用してケージの上部に戻します。
   3. ケージの蓋の各クランプを持ち上げ、ケージの側面を慎重に下げてから、白いタブを押し下げてケージの蓋を密閉します。
   4. ケージが密閉されたら、アシスタントにケージラックのドッキングサイトの各ノズルに二酸化塩素滅菌剤をスプレーしてもらいます。次に、ケージをフードから取り外してアシスタントに渡すと、アシスタントがケージをラックにドッキングできます。
   5. 転送ディスク内の各マウスについて、これらの手順を繰り返します。
4. バイオセーフティキャビネットの清掃
   1. すべてのマウスのアイソケージへの移動が完了したら、フードから破片を空にし、二酸化塩素滅菌剤を染み込ませたワイプで完全に拭き取ります。
   2. フードをイソプロピルアルコールで拭いて、残留二酸化塩素滅菌剤を取り除きます。フードの作業面の下のスペースには、滅菌プロセスから大量の滅菌剤が集められます。ドライワイプで吸収してこれを取り除き、イソプロピルアルコールで拭きます。.
   3. 液体二酸化塩素滅菌剤は、活性化後24時間後にシンクドレンを介して廃棄します。.滅菌剤で汚染された固形物は、通常の廃棄物として廃棄してください。
      注:アイソケージ条件に移された無菌マウスは、介入の前に新しい環境に順応するために1週間放置されます。これにより、研究結果に支障をきたす可能性のある動物が経験するストレスが軽減されます。この1週間の順応期間の終わりに、ステップ6で説明されているように糞便を収集し、介入の前に無菌状態を確認します。.

5. ヒト糞便スラリーの無菌マウスへの経口強制経口投与

1. オートクレーブ強制品の準備
   1. 経口強制経口投与針をセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1本)に入れ、滅菌1mLシリンジをセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1枚)に入れます。これらと600mLのポリプロピレンビーカー(マウス1匹につき1つ)と長い鉗子のペアをオートクレーブセーフバッグに入れ、オートクレーブで滅菌します。
   2. オートクレーブから袋を取り出した直後は、包装用テープで密封し、翌日まで保管してください。
2. 人間の糞便スラリーの調製
   1. 強制経口投与の日に、均質化して嫌気性保存培地(この場合は液体歯科用輸送培地)に保存したヒトの糞便を-80°C冷凍庫から嫌気性チャンバーに移します。均質化された糞便材料を、10mLの円錐管内の滅菌嫌気性生理食塩水で約1:10に希釈します。
   2. ヒトの糞便スラリーを含むチューブをパラフィルムで密封し、ボルテックスで均質化した後、200gで5分間遠心分離して微粒子を沈殿させます。
   3. チューブを嫌気性チャンバーに戻し、上清を別の10mL円錐チューブに移します。.ヒトの糞便上清を含むチューブをパラフィルムで密封し、嫌気性チャンバーから取り出し、二次漏れ防止容器に入れます。コンテナをオートクレーブ処理した強制品の袋と一緒に動物の飼育場所に運びます。
      注:報告目的では、強制経口投与を目的としたヒト糞便の総CFU/mLを推定することが不可欠です。適切なコロニー形成を確保するための最小CFU負荷がどの程度であるかは不明ですが、CFUが高いほど、ドナー便¹³の生着が改善されます。ヒトの糞便のCFU負荷により生着率が低くなる場合は、ヒトの糞便検体を回収してください。生存率保持培地を使用すると、収集された糞便検体からのCFU回収が向上します。ドナー糞便の嫌気性/好気性CFU数を決定するには、好気性および嫌気性BHIおよびLB寒天プレート上で、サンプルを1 x ^10-5 および各希釈のプレート10 μLに連続希釈します。24時間(有酸素性)と48時間(無酸素性)の後、便のグラムあたりCFUを数えます。
3. アイソケージの準備
   1. ステップ2と3を繰り返しますが、唯一の違いは、これらのケージにマウスが収容されていることであり、ラックの取り外しから30分以内に、各アイソケージが滅菌されたフードに配置され、マウスへの空気の流れを可能にするために蓋が通気されるように注意する必要があります。
   2. ステップ5.1および5.2のオートクレーブ滅菌材料バッグとヒト糞便スラリーチューブを、水ボトルと同様の方法で二酸化塩素滅菌剤飽和を介して滅菌します(つまり、滅菌剤に沈めてから滅菌剤に浸したバッグに入れます)。
   3. 20分間の滅菌期間終了後、アイソケージと経口強制経口供給をバイオセーフティキャビネットに移します。オートクレーブ滅菌された供給バッグを中に含まれる長い鉗子に押し付けて穴を開け、供給品を取り外してバッグをフードの外側に廃棄します。
4. 強制品
   1. 残留二酸化塩素滅菌剤がマウスと接触するのを防ぐために、耐薬品性手袋の代わりに新しい滅菌手術用ガウンと滅菌手術用手袋を着用してください。必要に応じて、このプロセスでアシスタントに助けてもらいます。
   2. 各滅菌ポーチを開梱して強制針を準備し、ポーチの内部を乾燥した滅菌済みの休息面として使用します。強制針を各シリンジに接続し、糞便スラリーチューブを開き、200μLの糞便スラリーを各シリンジに引き上げます。
   3. 鉗子を使用して、ケージ内の1匹のマウスの尾の付け根をつかみ、ワイヤーラックに置きます。マウスを擦り傷で優しく拘束し、マウスを直立した垂直位置に保持しながら針を挿入し、糞便スラリーを静かに注入した後、すぐに針を取り外してください。
   4. マウスを滅菌したカップの1つに直接入れて観察します。ケージ内のすべてのマウスについてこのプロセスを繰り返します。すべてのマウスが強制品を受け取った後、鉗子を使用して各マウスをケージベッドに戻し、ステップ4.3.2-4.3.4で説明されているようにケージをシールします。
      注:2つ以上の別々の糞便スラリーが使用されている場合は、バイオセーフティキャビネットと必要なケージと材料の完全な再滅菌が必要です。マウスのグループが無菌のままである場合、これらのマウスは、他のグループが治療される前に、制御強制猶予を受けることをお勧めします。
   5. 手順4.4の手順に従って、二酸化塩素滅菌剤および滅菌剤を浸した材料を廃棄します。人間の糞便スラリーで汚染された材料は生物医学廃棄物として処理し、環境衛生および安全手順に従って廃棄します。

6. 生存率維持のためのヒト化マウスからの便採取

1. オートクレーブ滅菌済み消耗品の準備
   1. 短いブロードチップ鉗子をセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1個)、600mLポリプロピレンビーカー(マウス1匹につき1個)、および長い鉗子のペアをオートクレーブ対応バッグに入れ、便採取手順の1日前にオートクレーブで滅菌します。
   2. オートクレーブから袋を取り出した直後は、包装用テープで密封し、翌日まで保管してください。
2. 保存培地チューブ調製
   1. 嫌気性生存率保存培地を選択します(ここではCary Blairを使用しました)。1 mLの保存培地を滅菌済みに分注し、バイオセーフティキャビネット内のスクリューキャップ2 mLチューブに入れます。最適な保存のためには、糞便:培地の比率を1:10にすることをお勧めします。
   2. 各チューブには油性マーカーを事前にラベル付けしますが、二酸化塩素滅菌剤にさらされると、プラスチック表面から永久マーカーラベルが剥がれる可能性があることに注意してください。別の方法は、チューブにラベルを付けないままにし、収集後すぐに凍結する前にアシスタントにチューブにラベルを付けることです。
   3. これらのチューブを標準的なポリプロピレン製チューブラックにセットして、チューブを直立させて保管しながら、二酸化塩素滅菌剤との接触による滅菌を可能にします。
3. 滅菌ケージとバイオセーフティキャビネット
   1. 手順2と3を繰り返して、アイソケージとバイオセーフティキャビネットを滅菌します。繰り返しになりますが、ラックを取り外してから30分以内に、各アイソケージを滅菌フードに入れ、マウスへの空気の流れを可能にするために蓋を通気するように注意してください。
   2. さらに、オートクレーブ滅菌された供給バッグと準備されたチューブを含むラックを塩素-二酸化物滅菌剤飽和によって滅菌し、ケージが入った浸漬ビニール袋に入れます。目標は、各チューブのすべての表面とラック自体との完全な液体接触です。
4. 糞便サンプルの収集と保管
   1. 20分間の滅菌期間終了後、アイソケージ、オートクレーブ滅菌済み消耗品、チューブラックをバイオセーフティキャビネットに移します。オートクレーブ滅菌された供給バッグを中に含まれる長い鉗子に押し付けて穴を開け、供給品を取り外してバッグをフードの外側に廃棄します。
   2. 残留二酸化塩素滅菌剤がマウスと接触するのを防ぐために、耐薬品性手袋の代わりに新しい滅菌手術用ガウンと滅菌手術用手袋を着用してください。必要に応じて、アシスタントにこのプロセスを手伝ってもらいます。
   3. 鈍い先端の鉗子は、ポーチを開梱し、ポーチの内側の表面を無菌エリアとして使用して準備します。チューブラックをバイオセーフティフードの表面に置きます。
   4. 長い鉗子を使用して、ケージ内の1匹のマウスの尾の付け根をつかみ、それらを滅菌したカップの1つに直接置いて観察します。ケージ内のすべてのマウスについてこのプロセスを繰り返します。
   5. 少なくとも2つの新しく通過した糞便ペレットが生成されるまでマウスを観察します。
      1. 鈍い先端の鉗子を使用して、糞便ペレットを拾い上げ、チューブに直接入れます。すぐにスクリューキャップの蓋を密封し、アシスタントに渡します。
      2. アシスタントにチューブにラベルを付けてもらい、ボルテックスによってスツールをすぐに均質化します。均質になったら、チューブを液体窒素でスナップ凍結し、-80°Cで長期間保存します。
   6. ケージ内の各マウスについて、便収集プロセスを繰り返します。糞便収集後、各マウスをホームケージに交換し、ケージをラックに再度ドッキングします。手順4.4を繰り返して、フードを清掃し、廃棄物を処分します。

ICIレスポンダーおよびノンレスポンダー表現型(プロトコルで以前に記載)によってプールされたヒト糞便サンプルを、グループごとに3つのアイソケージ(n = 1-2マウス/ケージ、レスポンダーのn = 6、ノンレスポンダーのn = 5)に飼育された男女混合GF-WTマウスに強制経口投与しました。マウスは、移植後1週間順応させられました。次に、これらのマウスから糞便サンプルを採取しました(無菌条件)。次いで、マウスをレスポンダーまたはノンレスポンダープールヒト糞便のいずれかの1×10^7CFU で強制経口投与した。その後、便は強制経口投与の1、2、および4週間後に採取されました。糞便サンプルは、無菌マウスの汚染物質の検出率が100%であるため、糞便サンプル¹⁴に加えて、ケージの寝具、水などをテストする必要はありません。これらのマウスの無菌状態を確認するために、移植後1週間でヒト糞便移植の前に、各マウスから1つの便ペレットを採取し、秤量した後、直ちに嫌気性チャンバーに移しました。各便サンプルを 1 mL の滅菌嫌気性リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、ペレット ペストル コードレス モーターと滅菌オートクレーブ滅菌ミキサーを使用して手動で均質化しました。次に、均質化された便を1 × ^10-5 に段階希釈し、各希釈液の10μLを嫌気性BHI寒天プレートに二重に播種しました。次に、各希釈液を嫌気性チャンバーから取り出し、好気性条件下でBHI寒天プレートに同じようにめっきしました。嫌気性プレートをパラフィルムで密封し、嫌気性チャンバー内で37°Cで48時間インキュベートしましたが、好気性プレートを好気性インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートしました。これらのマウスでは、希釈度や条件下で培養可能な糞便細菌が全く存在しないことから、無菌状態が確認されました。無菌サンプルを培養する際には、単一のコロニー形成単位(CFU)であっても許容できないため、偽陽性が疑われる場合(つまり、希釈係数が高いが他の希釈率が低い単一のコロニーがない)がある場合は、新しい便サンプルでこのテストを繰り返すことをお勧めします。汚染されたマウス、ケージ全体、および共同飼育されたマウスは、研究から除外する必要があります。ウイルスおよび真菌汚染物質の市販のPCRアッセイも実施して、無菌状態を検証することができます。

ヒト化マウスの経時的なコロニー形成を評価するために、前述のようにDNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HT(QIAGEN)を使用して、50〜70 mgのマウス糞便またはプールされたドナー糞便接種物をDNA用に抽出しました。糞便DNA抽出に続いて、16S rRNA遺伝子V1-V3超可変領域を、ユニバーサルIlluminaペアエンドアダプター配列を有するバーコード付きプライマーペアを用いて増幅し、PCR産物を精製、定量、および前述のようにプールし、Illumina MiSeq(2 × 300^)の1回のランでシーケンシングした。分析は、前述の¹⁵と同様に実施した。ヒト化マウスの糞便群集の構造は、3つの時点すべてで応答表現型間で有意に異なっていました(図3A-D)。興味深いことに、レスポンダー糞便にコロニーを形成したマウスは、1週目と2週目、および2週目と4週目の間に微生物群集の構造に差が見られませんでした(図3E-G)。ノンレスポンダー糞便コロニー化マウスは、1週目と2週目では異なる微生物群集構造を示しましたが、2週目と4週目では同様の群集構造を示しました(図3H-J)。両コロニー形成群の微生物群集構造は2週目と4週目で有意差がなかったことから、早ければ2週間で安定したコロニー形成に到達できることを示しています。レスポンダーヒト接種物に最初に見つかった571のアンプリコン配列変異体(ASV)のうち、35%が強制経口投与後1週間でコロニー形成されたマウスで、29%が2週間で、26%が4週間で発見されました。ノンレスポンダーヒト接種物で見つかった648のASVのうち、23%は強制経口投与後1週間のノンレスポンダーコロニーマウスで、23%は2週間で、21%は4週間で発見されました。ヒトドナー接種物は、Bacteroides、Lachnoclostridium、Marvinbryantia、Parabacteroidesの相対的な存在量が増加したレシピエントマウスと比較して、細菌属Blautia、Eubacterium、Ruminococcus、およびStreptococcusの発現が増加したことを示しました(図3K)。

図3:無菌マウスのレスポンダーまたはノンレスポンダーヒト糞便の経時的なコロニー形成 (A)コロニー形成後1、2、または4週間後の個々のマウス糞便間のBray-Curtis非類似性によって測定されたベータ多様性を示す主座標分析(PCoA)(R:n = 6;NR:n = 5)およびRまたはNRヒトドナーからのプールされたドナー便接種物(R接種物:n = 1;NR接種:n = 1)。(B)Bray-Curtisによって測定されたβ多様性を示すPCoAは、コロニー形成後1週間の個々のマウス糞便間の非類似性(R:n = 6;NR: n = 5) (P = 3.18 × ^10-7)。(C)コロニー形成後2週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似度によって測定されたベータ多様性を示すPCoA(R:n = 6;NR: n = 5) (P = 8.00 × ^10-8)。(D)コロニー形成後4週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtis非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA(R:n = 6;NR: n = 5) (P = 1.17 × ^10-7)。(E)コロニー形成後1週間または2週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA(R:n = 6)(P = 0.513)。(F)コロニー形成後1週間または4週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA(R:n = 6)(P = 4.87 × ^10-6)。(G)コロニー形成後2週間または4週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA(R:n = 6)(P = 0.835)。(H)コロニー形成後1週間または2週間の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA（NR:n = 5）（P=4.86 × ^10-4)。(I)コロニー形成後1週間または4週間のマウス糞便(NR:n=5)(P=1.35 × ^10-4)のBray-Curtis非類似性により測定されたベータ多様性を示すPCoA。(J)コロニー形成後2週または4週間のマウス糞便(NR:n=5)(P=0.046)の個々のマウス糞便間のBray-Curtisの非類似性によって測定されたベータ多様性を示すPCoA。P < 0.05 は統計的に有意であると見なされます。(K)ヒトRおよびNRドナー間の属レベルのアンプリコン配列変異体(ASV)の相対存在量バープロット(R接種物:n = 1;NR接種:n = 1)およびすべての時点にわたるレシピエントマウス(R:n = 18;NR:n = 15)で、主要な分類群がラベル付けされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここで説明するプロトコルは、実験的なアイソケージに収容された無菌マウスのヒト化のための再現性のある非常に詳細な方法を提供します。ヒトを対象とする糞便群集をマウス宿主に排他的に移植する能力は、マイクロバイオーム研究にとって非常に貴重です。マウス特異的な共生微生物叢による汚染がなければ、ヒトに常在する細菌がさまざまな健康状態や疾患状態に与える影響、または食事や薬物投与などの介入がヒト微生物叢に与える影響を研究することができます16,17,18。このような研究は、健康状態や病状におけるマイクロバイオーム組成の因果関係を実証するために不可欠です。このプロトコルには、保存培地中のヒト化マウス糞便の収集も含まれており、生存能力が保存された微生物をさらに使用するための回収を可能にします。ここで記載されていないさらなる応用は、単一の細菌株との単会合、またはAltered Schaedler植物相またはマウス腸内細菌コレクション(miBC)13,19,20のような定義された細菌群集とのコロニー形成である。これらのアプローチにより、介入や宿主因子に応答した特定の細菌株の制御性とトレーサビリティが可能になります。このプロトコルは、これらの定義されたコンソーシアムまたは単一の分離株の使用にも非常に適応性が高く、唯一の変更は、マウスへの経口強制経口投与の前に細菌を事前に培養する必要があることです。

ここで述べた代表的な結果は、適切な検出力を持つ実験を構成するものではないことに注意することが重要です。因果関係を決定するために、単一のドナーからの腸の「ヒト化」マウスは、単一の生物学的複製(ドナー)の技術的複製を構成するだけです¹⁹。因果関係を適切に検証するには、この実験を、完全に異なるドナーサンプル(理想的にはプールされたサンプルではなく単一のドナーからのサンプル)を使用して少なくとも2回繰り返す必要があります。我々の代表的な結果の場合、各時点でサンプリングされた単一のケージに複数のマウスがいることは疑似複製と見なされ、これらのデータを使用して因果推論を行うことはできなかった¹⁹。代わりに、適切に設計された実験では、ドナーごとに 1 つのケージが実験の 1 つのデータ ポイントと見なされます。これらの結果は、アイソケージシステムでの典型的な実験を実証するために提供されていますが、研究者は、研究を開始する前に、実験デザインに適切な検出力分析を適用するように注意する必要があります。

私たちの研究では、ドナーマイクロバイオームの組成はレシピエントの組成と類似していましたが、これらのヒト化マウスはドナーと同一ではありませんでした(図3A、K)。これは、ドナーサンプルの準備、レシピエントマウスの遺伝子型と食事、強制の頻度、ドナー便のCFU数、および元のドナー便の保存モードなど、多くの要因が糞便サンプルの無菌マウスへの生着率に影響を与えるため、予想されることです^{13,20。21,22}.1713人のヒトからGFマウスへの移植の結果を調べた研究では、ヒト種の47%のみがレシピエントマウスで再現され、移植された分類群の3分の1はドナーと相対的に存在量が一貫して異なることがわかりました²³。いくつかの研究は、より高い転移率とドナー組成との類似性を示していますが、したがって、腸の「ヒト化」は完全ではなく、可変生着はこの手順の制限として考慮する必要があります^24,25。生着の失敗は、レシピエントマウスへの表現型移植の失敗の原因である可能性があるため、これらの研究を実施する際には、この結果を測定するためのドナー便とレシピエント便のシーケンシングが非常に望ましいです。腸管「ヒト化」マウスモデルの結果を報告する際には、ドナー便の収集、調製、16S rDNAシーケンシングで定義された組成物、およびその他すべての関連する詳細に関する詳細な方法を慎重に記述し、再現性を確保する必要があります。

ヒトの糞便ドナーからマウスへの分類群の移行率は100%未満ですが、これはユニークな機会を表しています。疾患または応答表現型が腸内ヒト化マウスモデルで維持されている場合、マウスに移植された分類群を特定の機能に必要としない系統を除外する方法として使用でき、代わりにマウスに移植された分類群のみに焦点を当てることができます。生存率が保存されたヒト化マウス糞便は、細菌株の単離に使用してカスタム定義のヒト分離コンソーシアムを作成したり、機能研究のためにマウスに再度継代することができます。ヒト糞便ドナー便の量が限られている場合、生存能力が保存されたマウスレシピエント便のストックをヒトドナー便の代わりに使用して、マウスにコロニーを形成することができます。さらに、生存率が保存されたレシピエント便は、バイオリアクターシステムに接種して宿主から分離された微生物叢を研究するなど、さらなるアプリケーションにも使用できます。

ここで説明する個々のアイソレーターケージは、実験の柔軟性を提供し、多くのグループと並行して実験を行うために必要なコストとスタッフを削減します^9,10。しかし、アイソケージを使用すると、実験用アイソレータ^26,27よりも汚染のリスクが高くなります。ミニアイソレーターには食料と水が入っており、内容物を外部環境から保護するポータルエントリがあります。アイソケージはバイオセーフティキャビネットに移し、バイオセーフティキャビネット内で開く必要があるため、外部の汚染物質がケージの表面に接触してマウスに移される可能性が大幅に高まります。したがって、汚染の可能性は、バイオセーフティキャビネット内でアイソケージシステムが開かれる回数に直接関係しており、これは飼育要件により最低でも2週間ごとです。その結果、マウスをアイソケージに12週間以内に収容することが推奨される¹⁰。これにより、アイソケージでの実験的アプローチは、長期モデルを除く短期実験に限定されますが、アイソレーターハウジングアプローチには長期のコロニー形成研究がより適切です。イソケージシステムは、腫瘍産生や薬物治療を含む研究を可能にするなど、より頻繁な介入を必要とする実験的アプローチに特に適しています。

いくつかの代替アプローチでは、無菌をSPF条件に移行する(ex-GFモデルと呼ばれる)または抗生物質が枯渇したマウスに続いてヒト微生物叢の即時かつ反復的なコロニー形成を行い、元の糞便ドナー組成を部分的に再現します。これらのアプローチは、長期的な研究のためにドナー微生物叢がコロニーを形成することを可能にする有望であることが示されていますが、マウス特異的な共生細菌は依然としてこれらのモデルにコロニーを形成し、混合微生物群集(ヒトとマウス)につながります。これは、大量のヒトドナー糞便を使用し、コロニー形成を繰り返すことで部分的に軽減できます(時には毎日²⁸)。イソケージシステムにおけるヒト糞便サンプルを用いた無菌マウスのコロニー形成は、安定したコロニー形成のために単一の強制を必要とするだけであり、したがって、これらの代替アプローチよりもはるかに少ないドナー材料を必要とするが、追加の強制は、追加の時間とドナーの糞便材料を犠牲にして生着を強化することができる²¹。ヒトの糞便移動から無菌マウスへの88%という高い転移率は、以前の実験で達成されているが、議論したように、この速度は非常に変動性があり、糞便移植の成功を決定するものではない²⁴。

バイオセーフティキャビネット、アイソケージ、およびすべての材料と消耗品の滅菌は、プロトコルの最も重要な側面です。プライマリケージマニピュレーターは、二酸化塩素滅菌剤の洗浄手順を完了する際に注意しすぎることはありません。バイオセーフティキャビネットに入るものはすべて、滅菌剤との表面液体接触時間が20分でなければならず、オペレーターのミスが発生した場合、すべての材料とワークステーションを完全に再滅菌する必要が生じる可能性があります。バイオセーフティキャビネットを使用した後は、金属表面への酸化効果を減らすために、二酸化塩素滅菌剤とそれに続くアルコールで再度完全に洗浄することも重要です。ここで説明するプロトコルは、無菌繁殖とバイオセーフティキャビネットを備えた動物施設に広く適用できますが、並行して実行されるケージや実験の数によっては、手間がかかり、時間がかかる場合があります。アイソケージシステムの使用率が高い施設では、これらの実験の実行に必要な労力を大幅に削減する労働集約的な機器オプションがあります。たとえば、この目的のために設計されたバイオセーフティキャビネットシステムがあり、キャビネットに取り付けられた自動ダンクタンクが含まれており、各ケージを手動で清掃する必要がなくなります。さらに、オートクレーブ移送チャンバーはバイオセーフティキャビネットに取り付けることができ、二酸化塩素滅菌剤による表面滅菌を必要とせずに、オートクレーブされた材料をフードに直接移送することができます。高額な投資ですが、これらのオプションは、これらの実験を完了するために必要な時間と労力を大幅に削減し、このプロトコルの関連セクション内で簡単に置き換えることができます。

この実験プロトコルが失敗する最も一般的な理由は、汚染イベントです。イソケージの汚染源として最も可能性が高いのは、ボンネットの下での移し替えおよびケージ交換プロセスです。バチルス菌のような胞子形成細菌、およびブドウ球菌属のヒト皮膚共生細菌は、アイソケージ^26,27のノトバイオティクスマウスの汚染の最大のリスクです。汚染のリスクを制限するために、2週間のケージ交換以外で絶対に必要な場合にのみケージを開けることをお勧めします。状況によっては、その時間枠ですべての手順と介入をスケジュールすることは可能ですが、一部の実験的アプローチでは繰り返し開く必要があります。このような状況では、経験豊富なオペレーターが無菌状態をうまく維持できる可能性がありますが、無菌状態が維持されていることを証明するために、ケージの開口部ごとに糞便を収集してテストする必要があるかもしれません。さらに、動物の健康上の緊急事態や食料や水が不足している場合は、すぐにケージを開ける必要があります。そのため、動物の健康と福祉、および食物/水の供給レベルを注意深く監視し、これを可能な限り最小限に抑えることをお勧めします。

コンタミネーションイベントが繰り返し発生する場合は、バイオセーフティキャビネットとアイソケージの表面を綿棒で拭いて、微生物の増殖領域を特定することをお勧めします。作業面、エアフィルター、サッシ、側面、バイオセーフティキャビネットフードの開口部、および安全クロージャークランプ、HEPAフィルター、エアベント、およびアイソケージの内面を綿棒で拭きます。これらの綿棒を前述のように培養し、微生物が増殖している領域を特定します。汚染している細菌や真菌は、個々のコロニーのBiotyper MALDI-TOF分析によって特定できますが、分類群のグラム染色やqPCRも、マウスの汚染物質と環境中のこれらの汚染物質の潜在的な発生源の両方を特定するための実行可能な方法です。

このプロトコルの落とし穴は、動物がヒトの微生物叢にコロニーを形成している場合、非常に多様で未定義の微生物叢のために、外部の発生源からの汚染を検出することがほぼ不可能であることです。汚染が疑われる場合は、多くの時点にわたってマウス糞便の次世代シーケンシングを実施して、レシピエントマウスの便に存在するヒトドナーの糞便接種物に存在しない分類群を監視することをお勧めします。ヒトの糞便ドナー便からのすべての分類群がレシピエントマウスにコロニーを形成するわけではありませんが、マウスの糞便に存在するヒトの糞便に存在しない分類群があってはなりません。無菌の維持管理やドナー糞便のコロニー形成は、特に元のドナーサンプルの微生物群集組成がわかっている場合は、ユニバーサル16Sプライマーまたは分類群特異的プライマーを使用して、qPCRを介して縦断的にモニタリングすることもできます。しかし、この方法では生きている微生物と死んでいる微生物を区別できないという制限があります。また、アッセイを設計する際には、偽陽性のシグナルを排除するために、検証済みの無菌便コントロールを使用することも重要です。

要約すると、このプロトコルにより、実験的なアイソレーターケージでの無菌マウスの腸内細菌叢のヒト化に成功し、再現性のあるヒト化が可能となり、その後、これらのマウスから生存率が保存されたヒト化糞便標本を収集することができます。このアプローチは、健康と疾患の文脈で宿主と微生物の相互作用を研究するための重要なツールであり、イソケージシステム内でのさらなる実験的介入を設計するためのフレームワークを提供します。将来的には、このモデルを使用して、ヒトの腸内細菌叢と健康および疾患との間の多くの関連関係が検証されることが期待されます。

著者には利益相反はありません。

著者らは、グノトバイオティクスの飼育に関する支援を提供してくださったUF Animal Care ServicesのGerm-Free Services Division、獣医学およびIACUCの支援を提供してくださったBrooke Bloomberg博士とLaura Eurel博士、16S rRNA遺伝子シーケンシングの支援を提供してくださったJosee Gauthierに感謝しています。この研究は、UF Health Cancer Center Funds(CJ)およびUF Department of Medicine Gatorade Fund(CJ)によって部分的に支援されました。R.Z.G.は、UFヘルスがんセンターの資金によって支援されました。R.C.N.は、フロリダ大学(TL1TR001428年UL1TR001427月)の国立衛生研究所TL1トレーニング助成金、国立衛生研究所の国立がん研究所チームベースの学際的がん研究トレーニングプログラム賞のT32CA257923、およびUFヘルスがんセンターの支援を受けました。本書で報告された研究は、フロリダ州立大学がんセンター(UF Health Cancer Center)の支援を受けており、フロリダ州統計§381.915に規定されている州の予算と、米国国立衛生研究所の国立がん研究所(National Cancer Institutes)の賞番号P30CA247796によって部分的に支援されています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはフロリダ州の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。