沿岸湿地におけるメタン循環微生物動態の可視化

このプロトコルは、テキサス州南部の沿岸湿地で主要なメタン循環遺伝子を検出し、その空間分布を視覚化して、これらのダイナミックな生態系におけるメタン制御とその環境への影響の理解を深めます。

沿岸湿地はメタンの最大の生物源であり、メタン生成菌が有機物をメタンに変換し、メタン栄養生物がメタンを酸化するため、メタンサイクルの調節に重要な役割を果たしています。テキサス州南部の湿地は、頻繁な気象現象、塩分濃度の変動、気候変動による人為的な活動の影響を受け、メタン循環に影響を与えています。これらのプロセスの生態学的重要性にもかかわらず、テキサス州南部の沿岸湿地におけるメタン循環は、まだ十分に調査されていません。このギャップに対処するために、メタン生成菌のバイオマーカーとしての mcrA やメタン栄養生物のバイオマーカーとしての pmoA1、 pmoA2、 mmoX など、メタン生成菌やメタン栄養生物に関連する遺伝子を検出する方法を開発し、最適化しました。また、本研究では、地理情報システム(GIS)ソフトウェアArcGIS Proを用いて、メタン生成菌とメタン栄養物質の存在量の空間的・時間的分布パターンを可視化することを目的とした。これらの分子技術と高度な地理空間可視化の統合により、テキサス州南部の湿地におけるメタン生成菌とメタン栄養生物のコミュニティの空間的および時間的分布に関する重要な洞察が得られました。したがって、この研究で確立された方法論は、湿地の微生物動態をマッピングするための堅牢なフレームワークを提供し、さまざまな環境条件下でのメタン循環の理解を深め、より広範な生態学的および環境変化研究をサポートします。

沿岸湿地は、炭素隔離、蒸発散、メタン(_CH4^{)排出などの}プロセスを通じて、気候調節、生物多様性保全、水管理に貢献する重要な生態系です1。淡水湿地と海水湿地^{の両方を含む}これらの生態系2は、生産性が高く、二酸化炭素(CO₂)の取り込みの重要なゾーンとして機能し、陸域および海洋環境^3,4から有機物を捕捉します。これらの湿地内でのダイナミックな相互作用は、微生物のCH₄の生産^{と消費を刺激し}5、CH₄⁶の最大の天然源の1つとして位置付けられています。2番目に重要な温室効果ガスである_CH4は、_CO2の約27〜30倍の地球温暖化係数を持っています^4,7,8,9、^気候変動の時代には沿岸湿地からの_CH4排出量の研究が不可欠です。CH₄の放出は、さまざまな環境要因、特に塩分の影響を受け、微生物プロセスに重要な役割を果たしています¹⁰。淡水湿地は、硫酸塩レベルが低いため、大気中のメタンに大きく寄与し、微生物のCH₄産生が促進されますが、塩水湿地は一般的に硫酸塩濃度が高いため、_CH4の排出量が少なくなる傾向があります11,12,13。

沿岸湿地からの_CH4排出量は、一般に、メタン生成菌とメタン栄養生物¹⁴として知られる2つの微生物群によって制御されている。メタン生成菌は、ギ酸、酢酸、水素、メチル化化合物などの基質をメタン生成として知られるプロセスを通じて分解することにより、無酸素堆積物中に_CH4を生成します¹⁵。この経路における重要な酵素は、メチルコエンザイムMレダクターゼ(MCR)であり、メタン生成15,16,17の最終および律速ステップを触媒する。MCRのαサブユニットをコードするmcrA遺伝子は、すべてのメタン生成古細菌に見出される機能マーカーである¹⁸。さらに、沿岸湿地では、メタン生成帯の上に硫酸塩-メタン移行帯(SMTZ)が形成され、上向きに拡散するメタンと下向きに移動する硫酸塩が収束して枯渇します¹⁹。このゾーン内では、嫌気性メタン栄養古細菌(ANME)がMCR酵素を使用してメタンを二酸化炭素に酸化し、硫酸塩還元細菌(SRB)が硫酸塩を硫化物に還元します。SRBは、水素と酢酸でメタン生成菌を凌駕し、硫酸塩が枯渇するまでメタン生成を制限します^16,17。

対照的に、好気性メタン栄養細菌は、好気性環境²⁰で_CH4を酸化し、さまざまな形態のメタンモノオキシゲナーゼ(MMO)を利用します。これらには、細胞質内膜に埋め込まれた銅含有酵素である粒子状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO)や、細胞質に見られる鉄含有酵素である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)が含まれます。ただし、pMMOの場合、3つの遺伝子オペロンpmoCAB²¹があります。その中で、pmoA遺伝子はすべてのメタン栄養生物にとって最も保守的です。pmoAには、pmoA1とpmoA2の2つの異なるバイオマーカー遺伝子があります²²。さらに、メタン栄養生物を包括的に理解するために、mmoX遺伝子は、sMMO含有メタン栄養生物を同定するための分子生物学のツールとして使用されています²³。メタン生成菌と好気性メタン栄養生物の代謝経路と環境要件におけるこの違いは、沿岸湿地生態系におけるメタン循環を調節する複雑な微生物相互作用を浮き彫りにしています。

テキサス州南部の生産的な塩水環境であるボカチカ(BC)湿地は、メキシコ湾(GOM)からの潮汐の影響を受け、特に高塩分濃度のラグナマドレ²⁴に近いため、表面の塩分レベルが変動します。この潮汐作用は、満潮と干潮を交互に繰り返すため、酸素濃度が変動し²⁵ 、堆積物²⁶のメタン生成菌とメタン栄養生物の活性が変化する可能性がある。対照的に、沿岸の淡水湿地は、CH₄ フラックス²⁷の重要なホットスポットであると考えられています。レサカ・デル・ランチョ・ビエホ(RV)やロサノ・バンコ(LB)など、テキサス州南部の沿岸淡水湿地は、GOMの潮汐の影響から遠く離れており、水文学的な管理が明確です。RVは、水位が低いときには川の水によって補完されるパルスフローを経験しますが、LBはそのようなサプリメントなしでオフラインフローシステムとして機能します。さらに、RVとLBは、人工的に汲み上げられた淡水の大量排出とオックスボー湖であるため、それぞれ低い塩分レベルを維持しています。さまざまな環境要因が、テキサス州南部の沿岸湿地全体のメタン循環に大きな影響を与える可能性があります。しかし、テキサス州南部の沿岸湿地でのメタン循環は、まだ徹底的に調査されていない領域です。

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とリアルタイムPCR(定量PCR[qPCR]とも呼ばれる)は、環境サンプル中の特定の遺伝子の相対的な存在量を検出および定量するための基本的で広く利用されている技術です。これらの技術は、DNAの標的領域を特異的に増幅して、_CH4サイクリング関連遺伝子の存在と相対量を示し、潜在的なメタンサイクリングの指標を提供します。それにもかかわらず、PCRプライマーセットの利用可能性および有効性は、抽出された環境DNA中の様々な阻害因子によって制限される可能性があり、環境のタイプ^{によって影響を受ける28,29}。そこで、本研究では、主にテキサス州南部の沿岸湿地における_CH4循環関連遺伝子の存在を検出するための最適なPCR法を確立し(図1)、これらの生態系におけるそれらの定量化された相対存在量を可視化しました。この研究の結果は、他の沿岸地域に適用して、多様な沿岸生態系における_CH4サイクルと微生物動態の理解を深めることができます。

1.サンプル収集

1. 沈殿物グラブサンプラーまたはショベルを使用して沈殿物サンプルを収集します。
   注:サンプルは、2023年と2024年の涼しい季節(10月から2月、平均気温は20°C)と暖かい季節(4月から6月、平均気温は27°C)に、3つの異なる沿岸湿地の2つのステーションから収集されました。沿岸の淡水湿地からサンプルを採取する際には堆積物グラブサンプラーを使用し(図2)、潮汐の影響を受けた沿岸の塩水湿地ではシャベルを使用しました。
2. 最初にサンプラーを浅い水域に下げ、自重で堆積物表面(上部50cm以内)に沈むようにし、 図2に示すように堆積物構造への乱れを最小限に抑えます。
3. 深さが通常60 cmから215 cm³⁰であった水柱から引き出し、沈殿物サンプルをジップロックバッグに移し、すぐにアイスボックスに保管します。
   注:次のステーションに進む前に、グラブサンプラーを脱イオン(DI)水で洗浄して洗浄してください。
4. すべてのサンプルは、すぐに-20°Cでラボに保管してください。
5. 各サンプリングサイトで、マルチパラメータ水質計を使用して、塩分濃度や その場の温度 などの地表水質パラメータを測定します。
   注:プローブは、各ステーションで使用した後、脱イオン水(DI水)ですすいでください。

2. ゲノムDNA抽出

1. ゲノムDNA抽出の手順を開始する前に、サンプルを室温で解凍します。
2. 約500 mgの沈殿物サンプルを15 mLチューブに移し、4,250 × g で3分間遠心分離して水分をすべて除去します。
3. DNA抽出キットを使用して、製造元のプロトコル³¹ に従って土壌用のゲノムDNAを抽出し、少し変更を加え、すぐに-20°Cで保存します。
   注: この変更は、冗長性を減らし、ワークフローを効率化するために行われました。
   1. 最大500 mgの土壌サンプルをガラスビーズ/セラミック球体含有チューブに加えます。
   2. 978 μLのリン酸ナトリウムバッファーをビーズ/球状チューブ内のサンプルに加えます。
   3. ビーズ/球体含有チューブ内のサンプルに122 μLのバッファー溶解溶液を加えて、外部汚染物質を可溶化します。
   4. ビーズミルホモジナイザーを使用して、速度レベルの5倍で20秒間均質化し、2回繰り返します。
      注:この研究ではビーズミルホモジナイザーを使用したため、速度を調整しました。
   5. 混合物を14,000 × gで10分間遠心分離します 。
   6. 上清を清潔な2.0mL微量遠心チューブに移します。
   7. 250 μLのタンパク質沈殿液(PPS)を添加して、可溶化した核酸を細胞破片および溶解マトリックスから分離します。チューブを10倍反転させて混ぜます。
   8. 14,000 × g で5分間遠心分離してペレットを沈殿させ、細胞の破片と溶解マトリックスを除去します。
   9. 上清を清潔な15 mL微量遠心チューブに移します。
   10. 1.0 mLのBinding Matrix懸濁液を15 mLチューブの上清に加えます。
       注意: Binding Matrixサスペンションを振って再懸濁してから追加してください。
   11. DNAを結合マトリックスに結合させるには、チューブをローテーターに2分間置きます。
   12. すべてのチューブをラックに置き、3分間インキュベートして、結合マトリックスが沈降するまで待ちます。
   13. 3分後、750 μLを廃棄し、残りの上清をピペットを使用してペレットと穏やかに混合します。
   14. 混合物750μLをSPINフィルターに移し、14,000 μg×で1分間遠心分離します。 キャッチチューブを空にして再利用します。残りの混合物で繰り返します。
   15. 調製した洗浄液500μL(適量のエタノールを添加)を加えて、不純物をさらに可溶化します。ピペットチップからの液体の力を使用して、ペレットを穏やかに再懸濁します。
   16. 14,000 × g で1分間遠心分離し、不純物を除去します。キャッチチューブを空にして再利用します。
   17. 何も加えずに、再度14,000 × g で2分間遠心分離します。
   18. キャッチチューブを新しい清潔なキャッチチューブと交換し、SPINフィルターを室温で5分間風乾します。
   19. 50 μL の DNAse フリーウォーター (DES) を加え、14,000 × g で 1 分間遠心分離します。
       注:このプロトコルでは、抽出された環境DNA(eDNA)の最適な回収と安定性を確保するために、DNA溶出に50μLのDESを使用しました。

3. DNA定量

1. 抽出したDNA1 μLと蛍光色素200 μLを0.5 mLチューブに加え、ピペッティングで十分に混合します。
2. 光が透過しないように、すぐにチューブをアルミホイルで包み、室温で5分間インキュベートします。
3. 蛍光光度計を使用して、メーカーのプロトコルに従ってONE DNA濃度モードでDNA濃度を測定します。

4. 従来のPCRによる16S rRNA、 pmoA1 、 pmoA2 、 mmoX 、 およびmcrA の検出

1. 従来のPCR(cPCR)を実行する前に、氷のバケツですべてのサンプルと試薬を解凍します。
2. 抽出したすべてのeDNAサンプルを10 ng/μLに希釈します。
   注:プライマーのリストを 表1に示します。
3. 各サンプルについて、12.5 μL の 2x PCR マスターミックス、0.5 μL のフォワードおよびリバースプライマー (10 μM) (プライマーリストについては 表 1 を参照)、10 ng/μL eDNA 1 μL 1 μL、およびヌクレアーゼフリー水 10.5 μL を含む 25 μL cPCR 反応混合物を調製します。
   注:ピペッティングエラーを最小限に抑えるために、1つの追加サンプルに十分な量のマスターミックスを準備します。
4. 95°Cで2分間の初期変性、続いて95°Cで45秒間の変性、72°Cで30秒間の伸長、および72°Cで5mの延長からなるプロトコルに従ってcPCR反応を行い、プライマーごとに異なるアニーリング温度を使用します(異なる遺伝子に使用される異なるプライマーのアニーリング温度については表1を参照)。
   注: mcrA 遺伝子の場合、MLプライマーは、最初の5サイクル³²のアニーリングステップと伸長ステップの間に0.1°C / sの遅いランプ速度を使用して所望のバンドを示した。
5. エチジウムブロマイド(EtBr)で染色したアガロースゲル中のcPCR産物を可視化します。
   注:50 bpラダーには2.5%アガロースゲルを使用し、1 kbラダーには0.9%ゲルを使用します。2.5%アガロースゲルには1x TAEバッファーを、0.9%アガロースゲルには0.5x TAEバッファーを使用してください。

5. 定量的リアルタイムPCRによる pmoA1 、 pmoA2 、 mmoX、 mcrA の検出

注: pmoA1、 pmoA2、 mmoX、 およびmcrA の存在量などのメタン生成およびメタン栄養生物を標的とする遺伝子を、リアルタイムPCRシステムを用いたqPCRによって観察した。

1. 各遺伝子の標準試料を別々に調製し、各遺伝子の標準曲線を求めます。
   1. 各遺伝子のゲル電気泳動中に最も明るいバンドを生成したサンプルを使用して、cPCRで標的遺伝子を増幅します。セクション4に記載されている方法とプライマーに従ってください。
   2. ゲル抽出キットを使用して増幅産物を精製し、セクション3に記載されている方法に従ってDNA濃度を測定し、-20°Cで保存します。
      注:精製した標準試料を別々のチューブに分注して、さらに使用してください。
   3. qPCRのコピー数計算ウェブサイトを使用して、測定したDNA濃度から遺伝子コピーを計算します。
   4. qPCRを実行する前に、計算された標準のコピー数をヌクレアーゼフリー水で希釈し、各標準を10⁸ から 10² コピー/μLの範囲で調製します。
   5. 各コピー番号の 3 回の繰り返しを使用して、ネガティブコントロール(NTC、テンプレート DNA なし)を使用して標準曲線を調製します。
      注:各標準曲線のR² 値は0.99を超えていました。
2. すべてのサンプル、スタンダード、およびNTCについて、20 μL qPCR反応混合物を調製します。すべてのサンプルに対してqPCR解析をトリプリケートで実施します。
   1. 開始する前に、qPCRマスターミックス、プライマー、ヌクレアーゼフリー水、標準試料、サンプルを含むすべての反応成分をアイスラックに置きます。
   2. 各サンプル、標準試料、NTCについて、10 μLのSYBR Greenマスターミックス、10 μMのフォワードプライマーとリバースプライマー各0.5 μL、8 μLのヌクレアーゼフリー水、10 ng/μLテンプレートDNA、標準水、またはDI水のいずれかをそれぞれ含んだ20 μL qPCR反応混合物を調製します。
      注:示されているプライマーセットを使用して、従来のPCRの qPCRでpmoA1 および mcrA 遺伝子の最適な結果を得ることができます( 表1を参照)。精度を向上させるには、各サンプルをトリプリケートで実行します。次の手順は、サンプルあたり合計容量が 60 μL のトリプリケートサンプルを調製するための効率的な方法です。
      1. 反応混合物を調製して、マスターミックス、特定の遺伝子のフォワードプライマーとリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリーの水(テンプレートDNAを除く)を2 mLチューブに組み合わせます。
         注:ピペッティングエラーを考慮して反応混合物の量を準備してください。例えば、24 個のサンプルと 8 個の標準試料がある場合、ピペッティングエラーを最小限に抑えるために、32 個の反応ではなく 33 個の反応の総容量を計算します。この場合、トリプリケート反応に必要な総容量は、990 μLのマスターミックス(33サンプル×3回の繰り返し×10 μL)、49.5 μLのフォワードプライマー(33サンプル×3回の繰り返し×0.5 μL)、49.5 μLのリバースプライマー(33サンプル×3回の繰り返し×0.5 μL)、792 μLのヌクレアーゼフリー水(33サンプル×3回の繰り返し×8 μL)となります。
      2. サンプル数と標準に従ってPCRチューブを準備します。
      3. 調製した反応混合物57 μLを各PCRチューブに分注します。
         注:各サンプルに対して三重でqPCRを実行するには、サンプルあたり57 μLの総反応混合物量を調製します(テンプレートDNA、標準、または水を除く)。この容量は、1つのサンプルに対して3つのウェルに均等に分割され、各ウェルに19μLが割り当てられます。
      4. 各チューブに3 μLのテンプレートDNA、標準水、またはヌクレアーゼフリー水を加え、チューブの底を軽くたたいて混合します。
         注:1つのサンプルに対して調製された反応混合物の総量は、現在、各チューブで60μLになります。
   3. 調製した反応混合物20 μLを各チューブから96ウェルqPCRプレートの指定ウェルに分注します。アプリケーターを使用して、PCRプレートを接着剤PCRシーリングフィルムでシールします。
   4. 密封されたプレートを1,000 × g で1分間遠心分離し、ウェル内の気泡を排除するための適切な混合を確保します。
3. PCRプレートをサーマルサイクラーに入れます。qPCR装置の電源を入れ、関連ソフトウェアを開いてプロトコルを設定します。
   1. qPCRマスターミックスのガイドラインに従ってプロトコールをセットアップします。次のプロトコルを使用します:95°Cで10分間、続いて95°Cで15秒間、72°Cで30秒間の延長ステップ。 表1 の関連するプライマーに指定されているアニーリング温度で、アニーリングステップを45秒間実行します。すべてのqPCRランを35サイクル実施します。
   2. サンプル含有プレートと同じ構成で、スタンダードおよびNTCを使用して96ウェルqPCRプレートをセットアップします。
4. 絶対定量標準曲線法を使用して、増幅された製品と各サンプル³³の遺伝子コピー数を定量する。

6. テキサス州南部沿岸湿地の地図におけるメタン循環遺伝子の可視化

1. 地理情報システム (GIS) ソフトウェア ArcGIS Pro を開き、プロジェクト ファイルを Study Area という名前でコンピューター上の指定したフォルダーに保存します。
2. 左上の「地図」をクリックします |[ベースマップ] をクリックし、ベースマップとして [ラベル付きテレイン] を選択します。
3. [ 検索] |検索 し、検索バーが開いたら、エリアの名前を入力して分析エリアを見つけます。エリアが表示されます。
4. ジオリファレンスを使用して特定の領域を描画します。
   1. [表示] |最上位レイヤーの [カタログ ウィンドウ] をクリックします。
   2. カタログから フォルダ をダブルクリックします |ファイル名。
   3. ジオデータベース (*.gdb) ファイルを右クリックし、[新規作成] |[フィーチャクラス] と [フィーチャクラスの作成] が表示されます。
   4. 「名前」と「エイリアス」と入力し、下部にある「完了」をクリックします。
   5. [表示] |目次。エイリアスの名前がコンテンツ ウィンドウに表示されます。
   6. 最上層から[編集]をクリックします |作成します。[フィーチャ作成] ウィンドウが開きます。[フィーチャ作成] ウィンドウで [エイリアス] をダブルクリックすると、[Configure Tool Feedback Options] が表示されます。
   7. [ライン]を選択し、マップ上にラインをスケッチして、分析範囲の外側の境界を作成します。終了したら、マップをダブルクリックします。
5. GIS ソフトウェアを最小化してから、スプレッドシートを開きます。最初の列に サンプル名 を入力し、2 番目の列に 緯度 を入力し、3 番目の列に 経度 を入力します。次の 4 つの列は、 pmoA1、 pmoA2、 mmoX、および mcrA の qPCR データに使用します。
6. ファイルを CSV形式で コンピューターの特定のフォルダーに保存します。
7. GIS ソフトウェアを再度開き、[ データの追加] |XY ポイント データ。
8. [ 入力テーブル ] ボックスで、コンピューター上のフォルダーから CSV ファイルを選択します。 [出力フィーチャクラス] でファイル名を変更し、[ 実行 ] をクリックして、マップ上にサンプリング ポイントを表示します。
9. 上部のvsearchバーをクリックして、 Krigingを検索します。
10. サンプリング・ステーション・ファイルを選択し、 次にpmoA1を選択します。
11. [環境]をクリックします | レイヤーとマスクでサンプリングステーションを選択 |「実行」をクリックします。
12. 手順 6.9、6.10、および 6.11 で説明したプロトコルに従って、すべての分析範囲に対して pmoA2、mmoX、および mcrA の Kriging を作成します。
13. マップのレイアウトを作成します。
    1. [最上層から 挿入 ]をクリックします |[新しいレイアウト] をクリックし、[ ANSI - ランドスケープ] を選択します。
    2. [マップフレーム]をクリックし、クリギングのあるマップを選択し、長方形を描画してレイアウト内のすべてのマップを配置します。これにより、マップがレイアウトに表示されます。
    3. 方位記号を選択し、レイアウトに配置して北方向を示します。
    4. [縮尺記号] を選択すると、マップ上のエリアの縮尺が表示されます。
    5. [凡例] をクリックして凡例を表示し、レイアウトに配置します。
    6. [格子線] をクリックし、黒色の経緯線オプションのいずれかを選択します。これにより、緯度と経度のグリッドが作成され、コンテンツ ウィンドウに「Black Horizontal Label Graticule」というラベルで表示されます。
    7. 「Black Horizontal Label Graticule」をダブルクリックし、「Components」を選択します。Ticks 1 と Grid をクリックし、右側の十字記号をクリックしてこれらのコンポーネントを削除します。
14. 最上層から [共有 ]をクリックし、[ レイアウトのエクスポート]をクリックします。ファイル タイプとして [PDF] を選択し、[ 名前ボックス] を使用してファイルをコンピューターに保存し、垂直方向の解像度を 500 DPI に設定し、[ エクスポート ] をクリックしてマップの PDF ファイルを作成します。

テキサス州南部の沿岸湿地における_CH4サイクリング関連遺伝子(mcrA、pmoA1、pmoA2、mmoX)の分布と存在量を理解するために、各サンプルから抽出されたeDNAをcPCRとqPCRで解析しました。各バイオマーカーのユニバーサルプライマーは、以前の研究(表1)22,34,35,36,37からcPCRを実行するために選択され、サンプルの特性および環境条...

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