Studiamo le interazioni tra le tirosin-chinasi recettoriali e la membrana plasmatica dei mammiferi. Vogliamo sapere in che modo i raft lipidici e l'asimmetria lipidica guidano la localizzazione, l'attivazione e la segnalazione dei recettori. È difficile studiare direttamente le zattere lipidiche perché sono piccole, dinamiche e sensibili alle condizioni di temperatura.
I ricercatori devono spesso utilizzare sistemi modello con domini di ordine di grandi dimensioni per studiare le interazioni. Le vescicole sintetiche e le vescicole della membrana plasmatica sono rappresentazioni imperfette delle membrane cellulari prive di asimmetria lipidica e organelli. Lavorando con cellule vive, otteniamo una rappresentazione accurata della membrana plasmatica.
Evidenziano l'inizio della segnalazione del recettore nel contesto delle cellule vive. Ciò fornisce informazioni sull'effetto degli ambienti di membrana sui recettori e sulle loro vie di segnalazione a valle. Per iniziare, aliquotare lo stock lipidico in una provetta in borosilicato utilizzando una pipetta a spostamento positivo con punta di vetro.
Posizionare il tubo in borosilicato su un blocco riscaldante impostato a circa 50 gradi Celsius e applicare un flusso di azoto gassoso sul tubo fino a quando tutto il cloroformio apparente evapora. Trasferire il tubo in una camera a vuoto ed esporlo a vuoto per un'ora per rimuovere il solvente residuo. Quindi aggiungere il terreno F-12 di Ham's senza siero al film lipidico essiccato per raggiungere una concentrazione finale di 20 millimolari.
Copri il tubo con un coperchio o del nastro di teflon e scaldalo a bagnomaria a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, agitare la soluzione per sospendere i lipidi e formare vescicole multilamellari o MLV. Dopo che il terreno diventa torbido, trasferire l'intero volume in una provetta da microcentrifuga e conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di tre giorni.
Miscelare le MLV preparate con metilalfa ciclodestrina fino a una concentrazione finale di 40 millimolari. Incubare la miscela lipidica per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius o 55 gradi Celsius. Osserva i media che passano da nuvoloso a sereno.
Quindi, lasciare raffreddare il mezzo di scambio lipidico a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Ottieni cellule del recettore dell'insulina ovarica di criceto cinese cresciute a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in DMEM integrato contenente 4,5 grammi per litro di glucosio. Semina 1,5 volte 10 alla potenza di sei cellule in piastre da 60 millimetri e incubale per ottenere una confluenza dall'80 al 90%.
Quindi, lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS. Far morire di fame le cellule durante la notte in due millilitri di terreno F-12 di Ham senza siero. Dopo aver lavato tre volte le cellule con PBS, aggiungere un millilitro del mezzo di scambio preparato.
Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente, agitando ogni 15 minuti per garantire un'esposizione uniforme al mezzo di scambio. Quindi, lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS. Rimuovere completamente il PBS dalla piastra per colture cellulari e impostare la piastra a un angolo di 45 gradi per 10 minuti o fino a completa asciugatura.
Dopo aver rimosso il tampone residuo, aggiungere un millilitro di una soluzione di esano isopropanolo alle cellule essiccate e incubare per 10 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Trasferire ora la soluzione in una provetta in borosilicato. Dopo aver coperto il tubo, conservarlo a meno 20 gradi Celsius.
Quindi, sciogliere i detriti cellulari rimanenti utilizzando 500 microlitri di un normale idrossido di sodio. Agitare il contenitore per 10 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa dissoluzione. Per verificare l'efficienza di scambio, versare 100 millilitri di una soluzione di idrossido di ammonio al 30% di metanolo cloroformio in un serbatoio per cromatografia a strato sottile di vetro.
Coprire bene il serbatoio e lasciare che il vapore si equilibri per almeno un'ora. Essiccare il campione di estratto lipidico su un blocco riscaldante a bassa temperatura sotto un flusso di azoto gassoso fino a quando il solvente organico evapora. Quindi, sciogliere il film lipidico in 50 microlitri di una soluzione di metanolo di cloroformio uno-a-uno.
Utilizzando una siringa Hamilton da 10 microlitri, caricare da uno a 10 microlitri di campione su una piastra TLC in silice ad alte prestazioni. Applicare il campione in bande di un centimetro caricando un massimo di 10 bande per piastra da 20 centimetri. Posizionare la piastra TLC in posizione verticale nel serbatoio TLC e lasciare che la parte anteriore del solvente si sposti di otto centimetri per separare le specie fosfolipidiche.
Quindi, lasciare asciugare la piastra per 10 minuti e spruzzarla con una soluzione acquosa di acetato rameico al 3% e acido fosforico all'8%. Lasciare asciugare nuovamente la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente o con una pistola termica. La lastra dovrebbe passare dal blu traslucido al bianco opaco.
Quindi, carbonizzare la piastra in un forno temperato a 180-200 gradi Celsius per 5-10 minuti, o fino a quando non diventano visibili le bande lipidiche nere. Incubare le cellule trattate con 500 microlitri di insulina 100 nanomolare in terreno privo di siero per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule con PBS ghiacciato, posizionarle sul ghiaccio per interrompere la stimolazione.
Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato e raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare. Pellettare le celle a 3000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di tampone di lisi RIPA completo al pellet cellulare e risospendere da 30 a 40 volte per lisare le cellule.
Dopo aver incubato il lisato su ghiaccio per 10 minuti, centrifugarlo a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per separare i detriti. Raccogliere il surnatante in un tubo nuovo. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, mescolare il lisato con cinque volte il tampone laemmli e riscaldarlo a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Caricare quantità uguali di proteine per campione su un gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio per l'elettroforesi. Far funzionare il gel a 100-150 volt in un tampone di corsa fino a quando le proteine non sono ben risolte tra 100 e 250 kilodalton. Quindi, trasferire le proteine risolte su una membrana di fluoruro di polivinilidene utilizzando un tampone di trasferimento e colorare la membrana con gli anticorpi appropriati.
Lo scambio lipidico nelle cellule IR ovariche delle ovaie di criceto cinese ha comportato un aumento dell'intensità della banda della sfingomielina e una diminuzione dell'intensità della banda della fosfatidilcolina quando è stata scambiata la sfingomielina cerebrale. Al contrario, quando è stata scambiata la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina o DOPC, l'intensità della banda della fosfatidilcolina è aumentata, mentre l'intensità della banda della sfingomielina è diminuita. Le cellule scambiate con DOPC hanno mostrato una diminuzione dell'autofosforilazione IR insulino-dipendente.
Al contrario, le cellule scambiate con la sfingomielina cerebrale hanno mantenuto o aumentato moderatamente la fosforilazione IR. I livelli di fosforilazione normalizzati sono stati determinati dividendo l'intensità IR pYpY per l'intensità IR beta dai dati western blot.
