Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare i follicoli ovarici dalle cellule stroma circostanti per valutare le analisi di espressione genica su queste cellule germinali. Questa tecnica, utilizzando isolamenti enzimatici e meccanici controllati, consente il recupero dei follicoli mantenendo la loro integrità. Seguendo questo protocollo, il ricercatore può valutare specifiche espressioni geniche da queste cellule.
La tecnica potrebbe essere utilizzata per comprendere ulteriormente il deficit di espressione genica nei follicoli correlato a malattie che colpiscono la funzione ovarica o dopo l'esposizione ad agenti tossici. Iniziare a preparare una piastra a sei pozzetti aggiungendo cinque millilitri di soluzione crioprotettiva al primo pozzetto e cinque millilitri di terreno Leibovitz 15 con concentrazioni decrescenti di crioprotettore ai successivi quattro pozzetti. Rimuovere un flaconcino contenente un frammento corticale ovarico dall'azoto liquido nel rispetto delle norme di sicurezza.
Dopo 30 secondi a temperatura ambiente, o RT, immergere il flaconcino in acqua distillata due volte per due minuti. All'interno di un cappuccio verticale, agitare delicatamente e aprire la fiala del frammento corticale ovarico prima di trasferire il contenuto nel primo pozzetto della piastra a sei pozzetti posta sul ghiaccio. Quindi, trasferire successivamente il frammento corticale ovarico nel primo pozzetto in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente concentrazioni decrescenti di crioprotettore in cinque millilitri di terreno Leibovitz 15.
Agitare delicatamente il tessuto in ogni mezzo per cinque minuti. Per l'isolamento del follicolo, trasferire il tessuto ovarico scongelato in una piastra di Petri a griglia di due millimetri riempita con 10 millilitri di mezzo di dissezione, 30 microgrammi per millilitro di penicillina G e 50 microgrammi per millilitro di streptomicina. Regolare le dimensioni del tessuto con il bisturi, se necessario.
Accumulare i tre pezzi dell'affettatrice di tessuto e posizionare il frammento ovarico tra i due blocchi. Tagliare il frammento a metà usando una lama, facendo scorrere i blocchi per ottenere due frammenti di 0,5 millimetri di spessore. Tagliare il fazzoletto usando il trinciatutto per ottenere i pezzi più piccoli.
Se necessario, tagliare manualmente i pezzi rimanenti con il bisturi fino a quando il tessuto non si rompe. Una volta che il tessuto è rotto, trasferire il tessuto frammentato in una piastra di Petri a griglia riempita con sette millilitri di mezzo di digestione prima di posizionare il piatto nell'incubatore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Prendi la capsula di Petri dall'incubatrice ogni 10 minuti.
Lavare il tessuto pipettando il mezzo di digestione su e giù con una pipetta da un millilitro. Dopo 45 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, posizionare il piatto sotto uno stereomicroscopio con l'intervallo di ingrandimento da cinque a 6,3 volte e recuperare i follicoli utilizzando una pipetta micro capillare. Selezionare i follicoli di interesse e isolarli aspirandoli con una pipetta boccale.
Se i follicoli rimangono bloccati in un pezzo di corteccia, isolarli meccanicamente con due siringhe di calibro 27 strappando la corteccia con la punta delle siringhe e rilasciando i follicoli dallo stroma. Utilizzando il micro capillare, trasferire i follicoli isolati su una piastra a quattro pozzetti contenente 15 microlitri del terreno di coltura calibrato coperto da 500 microlitri di coltura oleosa. Dopo aver trasferito da uno a 10 follicoli, sciacquarli due volte in due gocce da 15 microlitri di PBS coperto con 500 microlitri di coltura oleosa per cinque secondi ciascuno.
Utilizzando la pipetta orale, raccogliere 20 follicoli con PBS minimo in un tubo vuoto e mantenere il tubo sul ghiaccio. Dopo 90 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo una soluzione che blocca il freddo. Sotto il cappuccio chimico, sospendere i follicoli isolati in 100 microlitri della soluzione di lisi fornita con il Kit di estrazione dell'RNA.
Vortice i follicoli isolati a 2500 RPM al minuto per rompere la loro struttura, quindi aggiungere 50 microlitri di etanolo al 100% al tubo. E brevemente vortice il tubo ad alta velocità. Dopo il vortice, trasferire il volume totale del tubo in un gruppo di cartucce micro filtro, comprendente una colonna e un tubo di raccolta.
E centrifugare l'assemblaggio per 10 secondi a 16, 363g a quattro gradi Celsius. Lavare la colonna con 180 microlitri di Wash Solution 1 fornito con il kit prima di centrifugare il tubo per 10 secondi. Dopo aver somministrato due lavaggi da 180 microlitri di Wash Solution 2, 3 alla colonna, asciugare il filtro centrifugando il tubo un'ultima volta e posizionare un nuovo tubo di raccolta sotto la cartuccia.
Per eseguire l'eluizione degli acidi nucleici, aggiungere prima otto microlitri di soluzione di eluizione a 75 gradi Celsius al gruppo filtro. Dopo un minuto, centrifugare il gruppo per 30 secondi. Ripetere questo passaggio con sette microlitri di Elution Solution.
Una volta fatto, aggiungere due unità internazionali DNase e DNase buffer al tubo e incubare il tubo per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Bloccare l'attività enzimatica con uno da 10 reagente di inattivazione della DNasi per due minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare il tubo per 1,5 minuti a 16, 363g a quattro gradi Celsius e trasferire la sospensione contenente l'RNA in un nuovo tubo.
Utilizzando uno spettrofotometro, valutare la quantità di RNA nel campione. Utilizzare una soluzione di eluizione da un microlitro come una soluzione vuota e una soluzione da un microlitro di RNA estratto da follicoli isolati. Controlla se il rapporto 260/280 è di circa 2,0 per la purezza dell'RNA.
E conservare il campione a meno 80 gradi Celsius o retrotrascriverlo direttamente per eseguire RT-qPCR. Utilizzando questo protocollo, i due frammenti ovarici omogeneizzati di 4x2x1 millimetri della stessa paziente sono stati elaborati per isolare i follicoli. La quantificazione dell'RNA ha rivelato che 4,8 nanogrammi per microlitro di RNA totale sono stati estratti da follicoli di dimensioni inferiori a 75 micrometri con un rapporto di purezza di 1,89.
Dai follicoli di meno di 200 micrometri, sono stati estratti 10,5 nanogrammi per microlitro di RNA totale con un rapporto di purezza di 1,74. I valori del numero di integrità dell'RNA, o RIN, erano 7,1 e 7,9 rispettivamente nelle provette uno e due, convalidando la qualità dell'RNA dai nostri campioni. Dopo aver eseguito un ciclo standard su un sistema di PCR in tempo reale, le soglie di ciclo, o TC, ottenute sono state 30,87 e 29,56 per HPRT, 33,5 e 31,77 per kit ligando e 30,71 e 30,57 per GDF9.
La digestione enzimatica del tessuto è un punto critico. Lo sperimentatore deve valutare continuamente e garantire l'integrità del follicolo durante la reazione interrompendola quando necessario. Oltre alle analisi di espressione genica, i follicoli isolati vengono utilizzati per sviluppare sistemi sperimentali per preservare la fertilità dei pazienti oncologici, come la coltura in vitro del follicolo o l'ovaio artificiale.
La tecnica di isolamento richiedeva una curva di apprendimento per recuperare un numero elevato di follicoli intatti. I ricercatori sono invitati ad assicurarsi che il tessuto sia ben frantumato prima della digestione.
