Abbiamo dettagliato un protocollo per stabilire un sistema 3D utilizzando una metrica extracellulare insieme a una di collagene per analizzare la formazione e l'espressione genica attraverso l'osteogenesi. Le metriche extracellulari possono aumentare la trasparenza del gel di collagene in una forma ed è adatto per esplorare la formazione di dendriti per le tecniche di imaging. Per iniziare lentamente, pipettare 0,9 millilitri di matrice di membrana basale in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri su ghiaccio e tenerla da parte.
Successivamente, rimuovere dall'incubatrice un filo interdentale T25 di cellule in coltura IDG SW3 in quattro millilitri di terreno completo integrato con interferone gamma. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS pH 7,4 con una pipetta. Quindi tripsanificare le cellule con 0,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 30 secondi.
Inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 millilitri di terreno completo. Trasferire quattro millilitri di pensione Celsius in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Far girare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere la tavolozza cellulare in un millilitro del terreno completo sul ghiaccio. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la densità cellulare finale con il terreno completo a quattro volte da 10 a cinque cellule per millilitro. Aggiungere 0,1 millilitri della sospensione cellulare preparata agli 0,9 millilitri della matrice extracellulare mantenuta in ghiaccio.
Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù. Mescolare delicatamente un millilitro della miscela di matrice cellulare e un millilitro di quella di collagene preparata in precedenza pipettando su e giù sul ghiaccio. Pipettare 0,5 millilitri della miscela finale in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per formare una miscela di gel cellulare.
Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 millilitri di terreno osteogenico alla miscela di gel cellulare in ciascun pozzetto. Per iniziare la differenziazione osteogenica a 37 gradi Celsius, consideralo come giorno zero. Ogni due giorni, sostituire metà del terreno con terreno osteogenico fresco e continuare la coltura per 35 giorni.
Rimuovere le soluzioni stock di calcio AM ed etidio uno dal congelatore e lasciarle riscaldare a temperatura ambiente. Aggiungere quattro microlitri di una soluzione madre di etidio a due millimolari e cinque microlitri della soluzione madre AM a quattro millilitri di calcio AM a due millilitri di DPBS e mescolare bene per ottenere due AM di calcio micromolari e uno di etidio a quattro micromolari come soluzione di lavoro. Per eseguire la colorazione cellulare il primo e il settimo giorno di coltura, pipettare 0,5 millilitri di soluzione di lavoro nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti e incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente per colorare la matrice di gel cellulare.
Aggiungere circa 0,5 millilitri di DPBS fresco a una nuova piastra di coltura con fondo in vetro da 35 millimetri e coprire la piastra per evitare la contaminazione o l'essiccazione dei campioni. Utilizzando una pinza con punta a gomito, trasferire con cautela la matrice di gel cellulare colorata nella piastra di coltura contenente DPBS senza danneggiare o tranciare la matrice di gel cellulare. Visualizzare le cellule marcate con un microscopio laser a fluorescenza confocale.
Posizionare la piastra di coltura contenente la matrice di gel cellulare colorata sul tavolino del microscopio. Selezionare le regioni della matrice di gel cellulare da scansionare attraverso l'oculare utilizzando un obiettivo 10x. Per impostare la scansione al microscopio, selezionare i filtri ottici.
Visualizza il calcio come verde con un filtro passa-banda fluorescente standard e quello di etidio come rosso con filtri per ioduro di propidio o colorante rosso Texas. Selezionare la modalità linea per la scansione, quindi fare clic sulla modalità di acquisizione per impostare le unità airy su un'au. Selezionare una profondità di dati a 8 bit e una risoluzione dell'immagine di 1024 x 1024 pixel.
Quindi selezionare il passo di linea e impostare la velocità di scansione su cinque. Per raccogliere la pila Z di immagini, definire le posizioni superiore e inferiore della matrice di gel cellulare da scansionare mettendo a fuoco il campione mentre si esegue la scansione continua in base al segnale del canale verde. Una volta specificati la parte superiore e inferiore del campione, selezionare il fotogramma di scansione desiderato e avviare la scansione.
Il campione viene scansionato dall'alto verso il basso con le impostazioni selezionate che generano una galleria di immagini. Per identificare le celle valide, selezionare una sezione dell'immagine. I canali verde e rosso indicano rispettivamente le cellule vive e morte.
Per identificare il dendrite cellulare, selezionare il singolo canale verde per generare ricostruzioni 3D con il software di acquisizione delle immagini, una serie di immagini a pseudo colori arcobaleno indicano le informazioni sulla profondità. I dendriti in basso sono visualizzati in rosso, mentre quelli in alto sono visualizzati in blu. In diversi giorni di coltivazione, rimuovere il terreno di coltura e lavare due volte i gel nella piastra con DPBS.
Aggiungere 0,5 millilitri o il 4% di paraformaldeide in DPBS al pozzetto per fissare la matrice di gel cellulare nella piastra per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide nel pozzetto e lavare la matrice di gel cellulare altre due volte con DPBS nella piastra come dimostrato in precedenza e lasciare 0,5 millilitri di DPBS in ciascun pozzetto per l'imaging. Posizionare la piastra sul tavolino dello stereomicroscopio e selezionare la posizione ottimale attraverso l'oculare utilizzando un obiettivo 0,5x.
Immagine, la vista a campo intero della matrice di gel cellulare nella piastra individualmente utilizzando l'esposizione automatica in campo chiaro. Il 35° giorno di coltura, controllare i livelli di azoto liquido e avviare il sistema XRF. Aprire la stanza del campione e trasferire i gel con una pinza a gomito dalla piastra al centro del tavolino di campionamento dello strumento.
Chiudere la stanza del campione e attendere 30 minuti per consentire allo strumento di raffreddarsi prima dell'uso. Impostare il tempo di esposizione su 35 millisecondi. La gamma di spettro da zero a 40 kilo elettronvolt e la corrente elettrica a 770 microampere per l'impostazione dell'acquisizione.
Spostando la fase di campionamento, scegliere da tre a cinque siti di scansione per l'analisi. Selezionare gli elementi calcio e fosforo. Avviare il rilevamento ed esportare i risultati.
In diversi giorni di coltivazione. Lavare due volte la matrice di gel cellulare rimossa dal terreno di coltura con DPBS ghiacciato come dimostrato in precedenza. Estrarre l'RNA totale dalla matrice di gel cellulare utilizzando il metodo dell'alcol isoamilico cloroformio fenolo.
Quindi trascrivere inversamente due microgrammi di RNA totale in CDNA con primer di esamero casuali. Posizionare la provetta su un termociclatore ed eseguire l'amplificazione PCR. Dopo la PCR, analizzare i cambiamenti di piega con il metodo TC a due delta.
La colorazione delle cellule morte vive visualizzata al microscopio laser confocale ha mostrato che tutte le cellule erano positive al calcio AM e quasi nessuna cellula positiva all'etidio uno, indicando che il sistema gel è altamente adatto per l'osteocitogenesi. I dendriti cellulari si sono gradualmente estesi in una rete nel mezzo osteogenico entro il settimo giorno. Un'immagine a colori della coltura del settimo giorno mostra gli androidi cellulari a diverse profondità nella parte inferiore e superiore del gel.
Vengono visualizzate immagini a tutto campo del gel con cellule e del gel senza cellule in una piastra a 24 pozzetti ai tempi indicati. La trasparenza della matrice di gel ha continuato a diminuire fino a quando non è diventata opaca al giorno 35, a differenza della matrice di gel priva di cellule. Lo spettro XRF del gel opaco il giorno 35 ha indicato che il gel era completamente pieno di depositi di calcio e fosforo.
L'espressione di diversi geni marcatori analizzati mediante PCR in tempo reale ha mostrato che i livelli di mRNA della podoplanina e della proteina della matrice dentinale sono aumentati continuamente dal primo giorno fino al giorno 21 e il livello di mRNA è diminuito dopo il giorno 21. I livelli di mRNA del fattore di crescita dei fibroblasti 23 e della sclerostina sono aumentati continuamente durante tutte le fasi. Il collagene uno e le metriche della membrana basale gelificano rapidamente e a temperatura ambiente.
Pertanto, tutti i puntali e i tubi utilizzati devono essere pre-raffreddati se non diversamente indicato. Si possono osservare eventi interessanti durante l'osteogenesi mediante tecniche di imaging. È più facile localizzare l'azione della molecola durante la formazione e l'allungamento dei dendriti.
