La co-colorazione dell'espressione di Nanos1 con l'etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Possiamo identificare la distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula nella medusa Cladonema. Possiamo visualizzare cellule staminali e cellule proliferanti nello stesso campione di meduse, che consente la rilevazione di cellule staminali proliferanti e non proliferanti, portando alla comprensione dell'eterogeneità delle cellule staminali.
Studi di biologia dello sviluppo e rigenerazione utilizzando modelli animali che includono cellule staminali. La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere tenuto in un ambiente di laboratorio senza alcun sistema specializzato. Cladonema medusae hanno tentacoli ramificati.
La ramificazione si verifica in un nuovo sito lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta. I tentacoli possono anche rigenerarsi entro pochi giorni dall'amputazione.
Le piccole dimensioni, la facilità d'uso e la presenza di cellule staminali adulte o cellule staminali rendono Cladonema un buon sistema per studiare il ruolo delle cellule staminali in diversi processi. Per iniziare, posizionare Cladonema medusae in tubi da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,5 millilitri e aggiungere ASW fino a un volume totale di 500 microlitri. Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione madre EdU da 10 millimolari e incubare i campioni per un'ora a 22 gradi Celsius.
Attendere un'ora e rimuovere il più possibile ASW contenente EdU. Dopo aver anestetizzato le meduse, incubare per cinque minuti. Fissare le meduse durante la notte a quattro gradi Celsius con il 4% di paraformaldeide in ASW.
Per il trattamento con proteinasi e post-fissazione, rimuovere la paraformaldeide e lavare i campioni con PBS contenente 0,1% Tween 20 tre volte per 10 minuti ciascuno. Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione. Incubare i campioni nel tampone di ibridazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il buffer di ibridazione e aggiungere il nuovo buffer di ibridazione. Pre-ibridare a 55 gradi Celsius per almeno due ore in un incubatore di ibridazione. Rimuovere il buffer di ibridazione e incubare con il buffer di ibridazione contenente le sonde.
Ibridare a 55 gradi Celsius per 18-24 ore in un incubatore di ibridazione. Quindi, procedere con la rimozione della sonda. Iniziare rimuovendo il buffer di ibridazione contenente le sonde e quindi aggiungere il buffer di lavaggio.
Lavare i campioni con tampone di lavaggio due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius. Rimuovere il tampone di lavaggio uno e aggiungere il tampone di lavaggio due. Lavare i campioni con tampone di lavaggio due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius.
Rimuovere il tampone di lavaggio due e quindi aggiungere 2X SSC. Lavare i campioni con 2X SSC due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius. Rimuovere 2X SSC e quindi aggiungere PBST preriscaldato.
Lavare i campioni per 15 minuti con PBST a temperatura ambiente. Per l'incubazione di anticorpi anti-DIG, iniziare rimuovendo PBST e quindi aggiungere l'1% di tampone di blocco. Incubare i campioni per almeno un'ora a temperatura ambiente agitando lentamente su un bilanciere.
Dopo il blocco, rimuovere il buffer di blocco dell'1%. Aggiungere la soluzione anti-DIG-POD e incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Per rilevare la sonda marcata DIG, rimuovere la soluzione anti-DIG-POD e aggiungere il tampone Tween tris cloruro di sodio.
Lavare i campioni con tampone tris sodium chloride Tween tre volte per 10 minuti a temperatura ambiente. Diluire la soluzione madre di tiramide coniugata con colorante fluorescente nel tampone diluente di amplificazione per ottenere la soluzione attiva di tiramide Cy5. Rimuovere il più possibile il tampone tris cloruro di sodio Tween e quindi aggiungere la soluzione attiva di tiramide Cy5.
Incubare i campioni per 10 minuti al buio. Lavare i campioni con PBST tre volte per 10 minuti al buio. Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti.
Rimuovere PBST e quindi aggiungere il cocktail di rilevamento EdU. Incubare il campione al buio per 30 minuti. Lavare con PBST tre volte per 10 minuti al buio.
Per la colorazione del DNA, diluire Hoechst in PBST per preparare la soluzione di Hoechst. Rimuovere il PBST e aggiungere la soluzione di Hoechst. Incubare i campioni per 30 minuti al buio.
Lavare i campioni con PBST tre o quattro volte per 10 minuti al buio. Successivamente per il montaggio, trasferire le meduse sulla banca sul vetro da vetrino usando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata. Posizionare delicatamente una copertina sulle meduse con una pinza e sigillare il lato della copertina con smalto trasparente.
La co-etichettatura dell'espressione di Nanos1 e delle cellule EdU positive ha rivelato il modello spaziale delle cellule staminali e delle cellule proliferative nel tentacolo. Le cellule EdU positive erano più ampiamente distribuite in tutto il bulbo tentacolare, mentre le cellule Nanos1 positive si sono accumulate più localmente nel bulbo tentacolare e nel nuovo sito di ramificazione, suggeriscono che vengono rilevate distribuzioni distinte di cellule staminali e cellule proliferanti a seconda dei tempi di sviluppo e delle diverse fasi. La co-etichettatura di EdU e Nanos1 è stata osservata nel 19,79% delle cellule, suggerendo che queste cellule sono una popolazione di cellule staminali attivamente proliferante.
Curiosamente, il 14,46% delle cellule è risultato essere Nanos1 positivo EdU negativo nel mezzo del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, suggerendo la presenza di cellule proliferative non staminali. Al contrario, il 26,32% delle cellule è stato osservato come Nanos1 EdU negativo positivo alla base del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, indicando la presenza di una popolazione di cellule staminali che è a ciclo lento o quiescente, nessuna delle quali viene rilevata dalla marcatura a impulsi EdU. La marcatura a impulsi EdU con breve tempo di incubazione consente di rilevare solo cellule proliferative tra cellule staminali e cellule non staminali.
Quando si cambia il tempo di incubazione per EdU e si combinano esperimenti di inseguimento a lungo termine, è possibile contrassegnare cellule staminali a ciclo lento o altri tipi di cellule, tra cui la progenie e le cellule differenziate.
