Questo protocollo introduce in dettaglio la localizzazione, la separazione e la fissazione dell'anello muscolare delle arterie coronarie del ratto. Fornire un nuovo metodo per i meccanismi, l'esplorazione e il trattamento di varie malattie cardiovascolari. Il sistema è adatto per la registrazione stabile dei cambiamenti dinamici della tensione arteriosa in vitro, leggendo in diametro da 60 micrometri a 10 millimetri.
Suggeriamo che i principianti dovrebbero prima comprendere con precisione la posizione anatomica di ciascun vaso e possono iniziare con vasi leggermente più grandi come l'arteria toracica e l'arteria mesenterica. Dopo aver dissociato e rimosso il cuore, iniziare drenando il sangue residuo da tutte le camere cardiache spremendo leggermente con una pinza di plastica medica. Posizionare rapidamente il cuore pre-elaborato in una capsula di Petri contenente il 95% di ossigeno e il 5% di soluzione salina fisiologica satura di anidride carbonica a quattro gradi Celsius, con un valore di pH di 7,40.
Per identificare con precisione la posizione anatomica delle arterie coronarie, regolare la postura del cuore isolato al microscopio ottico secondo il diagramma schematico. Tagliare le cavità ventricolari sinistra e destra lungo il setto interfiriale dalla radice dell'arteria polmonare con forbici chirurgiche e pinzette. Per dissociare le arterie coronarie sinistra e destra dal tessuto miocardico, sezionare il ventricolo destro sotto un microscopio anatomico ottico per esporre a fondo il ramo dell'arteria coronaria destra.
Quindi identificare la posizione dell'arteria coronaria sinistra ruotando il tessuto cardiaco di 45 gradi in senso orario. Dopo aver rimosso il tessuto miocardico appiccicoso circostante, discernere esplicitamente le arterie coronarie sinistra e destra pulsanti. Separare immediatamente le arterie coronarie nel mezzo e immergere completamente nella soluzione salina fisiologica a quattro gradi Celsius.
Acquisire un anello arterioso di circa due millimetri tagliando verticalmente l'arteria staccata con forbici anatomiche per registrare la tensione vascolare sotto diversi stimoli. Preparare due fili di acciaio inossidabile di due centimetri e pre-immergere in soluzione salina fisiologica a quattro gradi Celsius satura di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Passare entrambi i fili parallelamente attraverso l'anello arterioso insieme alla direzione del vaso sotto un microscopio anatomico ottico e con fili di uguale lunghezza esposti ad entrambe le estremità della cavità vascolare.
Fissare l'anello arterioso con il filo d'acciaio davanti e dietro nella vasca da bagno della micrografia del filo riempita con soluzione salina fisiologica gorgogliante con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Ruotare la manopola a vite orizzontale per una spaziatura anteriore e posteriore appropriata in modo che i due fili siano orizzontali e l'anello arterioso sia in uno stato naturale di rilassamento. Dopo aver installato il bagno DMT sull'apparato termostatico, aprire il software di acquisizione dati per assicurarsi che sia stato registrato il segnale del percorso corrispondente.
Impostare i parametri. Ottenere la tensione iniziale ottimale dell'anello arterioso applicando una tensione ragionevole lungo il diametro del vaso. A questo punto, impostare il valore di tensione vascolare visualizzato su zero.
Successivamente, applicare uno stimolo di impulso di Tre Milli Newton all'anello arterioso ruotando l'asse a spirale del bagno. Fare clic sul pannello LCD per impostarlo su zero milli Newton e mantenerlo per un'ora. Dopo l'incubazione per un'ora in tampone di soluzione salina fisiologica satura di ossigeno a 37 gradi Celsius pH 7,40, impostare nuovamente il valore di tensione su zero milli Newton sul pannello di controllo della tensione della micrografia a filo.
Eseguire l'attività contrattile dell'anello coronarico con la tecnica del miografo a filo e convalidare in tre operazioni separate stimolando con 60 millimolari di soluzione di ioni di potassio per 10 minuti ciascuna. Dopo ogni stimolazione, lavare il bagno con la soluzione salina fisiologica satura di ossigeno fino a quando il tono vascolare ritorna al suo stato iniziale. Aggiungere 0,3 micromolari U46619 a bagno e osservare per 10 minuti.
Aggiungere un'apigenina micromolare e osservare gli effetti vascolari. Quando la dilatazione raggiunge un plateau, aggiungi la concentrazione successiva. Aggiungere un'apigenina micromolare alla soluzione di pre-restringimento di potassio 60 millimolare per osservare l'effetto vascolare.
Quando la dilatazione raggiunge un plateau, aggiungi la concentrazione successiva. Aggiungere 28 millimolari di ioni di potassio all'anello vascolare a riposo. Quando la contrazione raggiunge un plateau, aggiungi la concentrazione successiva.
Aggiungere 0,01 micromolari U46619 all'anello vascolare a riposo. Quando la contrazione raggiunge un plateau, aggiungi la concentrazione successiva. Dopo che una tensione iniziale di Newton di tre milli è stata applicata all'anello arterioso, la sua tensione ha superato più di due milli Newton applicando una concentrazione di ioni di potassio 60 millimolari in parallelo tre volte.
Così le procedure di cui sopra avevano portato ad un anello coronarico isolato con un'eccellente attività fisiologica. La concentrazione cumulativa di ioni di potassio o U46619 è stata aggiunta al bagno di DMT620M, con conseguente aumento dipendente dalla concentrazione del tono vascolare in vitro. La successiva concentrazione di ione potassio o U46619 è stata aggiunta quando l'effetto vasocostrizione ha raggiunto un plateau.
Per gli anelli coronarici isolati ristretti dallo ione potassio e dall'U46619, il farmaco di prova apigenina ha causato vasodilatazione in modo sorprendentemente dipendente dalla concentrazione. Il cuore viene sezionato lungo il setto ventricolare dalla radice dell'arteria polmonare, esponendo e separando l'anello muscolare coronarico di due millimetri. Seguendo questa procedura, possiamo registrare la tensione vascolare nei microvasi retinici, nella funzione renale, nell'arteria renale e nell'arteria cerebrale media.
Una regione dinamica da 60 micrometri a 10 millimetri.
