Il mio laboratorio è specializzato nella modellazione tumorale tridimensionale e quadridimensionale. I modelli sferoidi tumorali sono ampiamente utilizzati in biologia e scoperta di farmaci. Tuttavia, i protocolli esistenti per la raccolta dei dati da questi esperimenti sono costosi, difficili e limitati.
Questo protocollo richiede sostanze chimiche e attrezzature facilmente accessibili e non richiede molto lavoro rispetto ai metodi attuali che forniscono risultati simili. Questo protocollo è stato sviluppato per essere relativamente facile da implementare per i principianti e robusto per piccoli errori, poiché molti dei passaggi sono reversibili. Inizia pesando 0,5 grammi di agarosio a basso punto di fusione in una bottiglia di vetro.
E aggiungere 25 millilitri di PBS. Sciogliere l'agarosio facendo bollire la soluzione in un microonde per 30-60 secondi con il coperchio chiuso e ruotando costantemente. Pesare nove grammi di N, N, N'N'Tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina, 22 grammi di urea, 44 grammi di saccarosio, 0,1 grammi di Triton X-100 e 24,9 grammi di acqua deionizzata.
Riscaldare la soluzione a bagnomaria a 56 gradi Celsius con miscelazione costante. Dopo che i cristalli sono stati sciolti, riposare la soluzione a temperatura ambiente per consentire alle bolle formate durante la miscelazione, di salire in superficie. Generare sferoidi usando il metodo di sovrapposizione di agarosio descritto nel manoscritto testuale.
Tagliare la punta di una punta di pipetta da un millilitro usando un bisturi per allargare l'orifizio. Utilizzando la pipetta, aspirare gli sferoidi dai pozzetti e trasferirli in un tubo conico trasparente da 1,5 millilitri. Più sferoidi delle stesse condizioni possono essere combinati nello stesso tubo.
Lavare gli sferoidi due volte in un millilitro di PBS, quindi aggiungere una soluzione neutra di paraformaldeide preriscaldata al 4% e incubare gli sferoidi a 37 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare gli sferoidi due volte con un millilitro di PBS. Quindi per la colorazione, trasferire fino a 15 sferoidi in un tubo PCR da 200 microlitri, utilizzando una pipetta.
Permeabilizzare le cellule utilizzando 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% in PBS. Posizionare i tubi PCR all'interno di tubi da 50 millilitri, con tappo a vite e coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare gli sferoidi a temperatura ambiente con lieve agitazione. Dopo due ore, sostituire la soluzione con 200 microlitri di tampone anticorpale e incubare per una notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, rimuovere il tampone di diluizione degli anticorpi prima di aggiungere 75 microlitri di anticorpo primario e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni e mezzo. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante e lavare gli sferoidi due volte con 200 microlitri di PBS, contenente 0,1% Tween e 0,1% Triton X-100 o PBS-TT. Quindi incubare con 200 microlitri di PBS-TT per quattro ore a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere PBS-TT prima di aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni e mezzo. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS-TT, prima di incubare con 200 microlitri di PBS-TT per quattro ore. Per il montaggio, utilizzare una pipetta da 200 microlitri, trasferire sferoidi fissi e colorati in tubi PCR da 500 microlitri, in un tubo per condizione.
Sostituire la soluzione con 200 microlitri di gel di agarosio liquido al 2% e centrifugare sulla centrifuga rapida, alla velocità massima fissata, a temperatura ambiente, per 30 secondi. Aspirare gli sferoidi in 50 microlitri di gel di agarosio liquido ed erogare nel pozzetto di una piastra di fondo di vetro a 24 pozzetti. Prima che il gel si indurisca, separare gli sferoidi usando una punta di pipetta nel gel circostante e assicurarsi che gli sferoidi siano coperti di gel.
Quindi, immergere il gel aggiungendo 500 microlitri di soluzione di pulizia per pozzetto e incubare a temperatura ambiente, al buio, per 24 ore prima dell'imaging. Per l'imaging, scegli un obiettivo con una distanza di lavoro abbastanza lunga da comprendere l'intero sferoide, compresa l'altezza di montaggio dello sferoide nella nave. Per identificare il piano equatoriale, regolare la messa a fuoco fino a raggiungere la superficie più grande nel piano XY e visualizzare l'immagine con la percentuale di potenza laser, la tensione del rilevatore, il guadagno e le impostazioni di offset richieste.
Per le immagini tridimensionali, impostare l'inizio e la fine degli sferoidi e scegliere l'intensità del segnale appropriata a varie profondità Z, utilizzando le impostazioni di correzione dell'intensità Z. Questo studio mostra un confronto tra sferoidi per melanoma umano FUCCI e non eliminati, rispetto agli sferoidi montati su PBS. La soluzione di clearing fornisce immagini ad alta chiarezza con una distorsione delle dimensioni minima.
La soluzione di clearing consente inoltre l'imaging ad alta risoluzione dei dettagli a livello cellulare più in profondità negli sferoidi senza sezionamento istologico. Con immagini confocali tridimensionali, è possibile ottenere dettagli a livello cellulare a una profondità di 200 micron. Inoltre, viene mostrato un confronto tra sferoide a foro criosezionato e cancellato, colorato per pimonidazolo e p27kip1.
La colorazione del pimonidazolo mostra la regione ipossica dello sferoide e la colorazione p27kip1, segna l'arresto del ciclo cellulare e la colorazione nucleare DAPI. Una penetrazione più profonda e una minore dispersione, consentono una migliore rappresentazione tridimensionale della struttura sferoidale con una minima perdita di luce. Viene mostrato il rendering tridimensionale degli sferoidi FUCCI, colorati con DRAQ7.
La soluzione di compensazione ha un impatto minimo sulle dimensioni degli sferoidi. Il diametro dello sferoide è stato definito sulla base di una sfera con la stessa area della sezione trasversale dello sferoide. Gli sferoidi sono stati osservati aumentare leggermente di dimensioni nelle prime sei ore, come indicato da un cambiamento di piega del diametro compreso tra il 2% e il 6% Al contrario, dopo 24-72 ore, gli sferoidi sono tornati a una dimensione approssimativamente uguale alla dimensione corrispondente nella fissazione post-paraformaldeide PBS.
È importante attendere almeno 24 ore prima dell'imaging, per lasciare che la soluzione di compensazione si equilibri con gli sferoidi e il gel. Questo protocollo consente ai professionisti di raccogliere rapidamente dati da un gran numero di sferoidi, consentendo un'analisi matematica e statistica quantitativa dettagliata che fornisce approfondimenti dettagliati sulla biologia.
