Un protocollo efficace per mantenere e amplificare il nematode entomopatogeno è essenziale per comprendere le basi molecolari della patogenicità dei nematodi e dell'immunità anti-nematodi dell'ospite. Questo protocollo ci consente di produrre un elevato numero di Heterorhabditis bacteriophora simbiotici e ascinici e Steinernema carpocapsae IJ utilizzando l'ospite insetto, Galleria mellonella. Iniziate coprendo la capsula di Petri con un pezzo di carta da filtro e aggiungete circa 10-15 larve di Galleria mellonella.
Usando una pipetta, erogare due millilitri di acqua contenenti circa 25-50 giovani infettivi per 10 microlitri di sospensione sui vermi di cera. E conservare la capsula di Petri in un armadietto a temperatura ambiente. A seconda dell'umidità della carta da filtro, aggiungere uno o due millilitri di acqua ogni due giorni.
I vermi di cera infetti da giovani infettivi di solito muoiono entro 48 ore. Preparare le trappole d'acqua di White circa 10 giorni dopo che i vermi di cera sono stati infettati dai giovani infettivi. Trasferire con cura gli insetti morti sulla parte non imbevuta della carta da filtro.
Utilizzare l'acqua del rubinetto per riempire la capsula di Petri inferiore e posizionare un tappo di un tubo da 15 millilitri come distanziatore per la ventilazione. Utilizzare l'acqua del rubinetto invece dell'acqua demineralizzata o deionizzata per evitare l'aggregazione dei nematodi e assicurarsi che il livello dell'acqua nella trappola dell'acqua raggiunga circa la metà dell'altezza della capsula di Petri. Quando l'acqua nella piccola capsula di Petri diventa torbida a causa dei nematodi, utilizzare una pipetta per spostare la nuova generazione di giovani infettivi in un pallone di coltura cellulare T25 o T75.
Successivamente, aggiungere acqua del rubinetto fino al 40% di volume o fino a raggiungere la densità appropriata. E conservare il pallone di coltura cellulare orizzontalmente per evitare la congestione dei nematodi. Ripetere il trasferimento di novellame infettivo in palloni di coltura cellulare e l'aggiunta di acqua fino a quando i giovani infettivi smettono di emergere dalle carcasse di insetti in circa tre o cinque giorni.
Usando un ciclo di inoculazione, raschiare diversi fiocchi di una coltura congelata di Photorhabdus temperata Ret16 su una piastra MacConkey e una striscia per singole colonie. Incubare la piastra per due o tre giorni a 28 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, inoculare 10 millilitri di brodo LB con una colonia su agar MacConkey in un tubo da 50 millilitri e incubare la coltura durante la notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante.
Dopo l'incubazione, trasferire 100 microlitri di coltura notturna da un tubo da 50 millilitri in un nuovo tubo microcentrifuga, quindi lavare 100 la coltura notturna con 900 microlitri di PBS a singola resistenza mediante centrifusione, in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, a 17.900 volte g. Decantare il surnatante. Quindi, diluire la coltura 10 volte in PBS a singola forza e lasciare il tubo sul ghiaccio.
Ora, immergere i vermi di cera in una soluzione di etanolo al 70%. Dopo aver asciugato gli insetti con un tovagliolo di carta, metterli in un tubo da 50 millilitri. Posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti per immobilizzare i vermi di cera.
Usa la carta da filtro per coprire la metà superiore e inferiore di una capsula di Petri. Utilizzare il coperchio della capsula di Petri coperto con carta da filtro come supporto di base per l'iniezione. Inumidire la carta da filtro della capsula di Petri inferiore e trasferirla sul ghiaccio per aiutare i vermi di cera iniettati a recuperare.
Pipettare 50 microlitri di batteri ghiacciati su un pezzo di Parafilm, quindi preparare una siringa ad ago raffinatore calibro 22 e premere delicatamente lo stantuffo per rimuovere l'aria sulla punta dell'ago. Mantenere un verme di cera vicino all'estremità posteriore sotto lo stereoscopio. Iniettare la coltura batterica nel lato dorsale del torace.
Preferibilmente alla giunzione tra due segmenti appena sotto la cuticola parallela al verme della cera per ridurre al minimo i danni interni e prestare attenzione a come il corpo larvale inizia a gonfiarsi. Quindi, trasferire gli insetti iniettati nella piastra di Petri di recupero. E una volta che tutti gli insetti vengono iniettati e collocati nel piatto di recupero, posizionare la capsula di Petri al buio.
I vermi di cera soccombono due giorni dopo l'iniezione e appaiono rosso mattone dopo circa tre o quattro giorni. Tuttavia, gli insetti di colore marrone indicano un'infezione batterica non riuscita. A sette giorni dall'infezione, trasferire gli insetti con il caratteristico colore rosso mattone su una capsula di Petri rivestita di carta da filtro fresca e ripetere la produzione di giovani infettivi al nematode simbiotico.
Per iniziare la sterilizzazione superficiale, raccogliere sufficienti simbiotici, heterorhabditis bacteriophora e candidati giovani infettivi axenici mediante centrifugazione. Per produrre un pellet in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri, aggiungere 500 microlitri di candeggina al 5% al pellet in ciascun tubo microcentrifuga e invertire il tubo. Dopo l'incubazione per 10 minuti, centrifugare a 17.900 volte g per un minuto e rimuovere il surnatante.
Quindi lavare il pellet con un millilitro di acqua sterile. Centrifuga, rimuovi il surnatante e ripeti questa procedura altre quattro volte. Il grafico mostra i risultati della valutazione dello stato dei nematodi batteriofori eterohabditis che hanno subito l'axenizzazione.
Heterorhabditis bacteriophora dalla coltura stock trasportato cellule simbiotiche Photorhabdus luminescens. Tuttavia, i nematodi privi dei loro batteri Photorhabdus luminescens associati erano ascinici. Per mantenere la riproducibilità del tuo esperimento, striscia sempre fresco dalla coltura batterica di una colonia fresca ed estrai la coltura notturna prima che raggiunga la faccia stazionaria.
Usa solo il verme di cera Galleria rosso mattone per la trappola d'acqua di White e scarta il resto. Dopo questa procedura, i nematodi possono essere utilizzati per studiare l'interazione con il sistema immunitario degli insetti. Questa tecnica apre la strada al ricercatore per esplorare le basi molecolari del parassitismo dei nematodi e dell'immunità anti-nematode dell'ospite.
