Questo protocollo aiuta a isolare la microglia dalle lesioni demielinizzanti microdissecate del cervello del topo adulto per studiare le caratteristiche microgliali in vivo. Questa tecnica consente di risparmiare tempo e ha requisiti inferiori sia per gli sperimentatori che per le attrezzature. Questo metodo aiuta a isolare le microglia dal cervello dell'animale, in particolare quei tessuti microdissezionati in vari stati patologici.
Inizia microdissezionando le lesioni etichettate con colorante neutro attorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio. Centrifugare il tessuto sezionato a 300 volte g per 30 secondi per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Preriscaldare la miscela enzimatica uno e la miscela enzimatica da due a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.
Quindi, aggiungere 1.950 microlitri di miscela enzimatica preriscaldata uno a un campione e digerire in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di enzima preriscaldamento mescolare due e mescolare delicatamente. Dopo la digestione, aggiungere quattro millilitri di PBS freddo al tubo e agitare delicatamente.
Centrifugare i campioni di tessuto a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante lentamente e completamente. Risospesciare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 microlitri di PBS freddo. Aggiungere 450 microlitri della soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolarli bene.
Utilizzare una pipetta da 1.000 microliti per sovrapporre la miscela molto lentamente e delicatamente con due millilitri di PBS freddo. Centrifugare la miscela e quindi cercare i tre strati. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aspirare completamente i due strati superiori e riempire il tubo fino a cinque millilitri con tampone di carico a freddo.
Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Successivamente, dopo la centrifugazione e l'aspirazione del surnatante, risospesere il pellet di cella con 90 microlitri di buffer di carico e aggiungere 10 microlitri di perline CD11b. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del tampone di carico e lavare le cellule convogliando delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 microliti. Centrifugare le cellule a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate. Risospesciare le celle in 500 microlitri del buffer di carico e posizionare la colonna MS con il suo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.
Risciacquare la colonna con 500 microlitri del buffer di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente le celle senza etichetta. Aggiungere 500 microlitri del buffer di carico per lavare la colonna e rimuoverla dal separatore.
Posizionare la colonna su un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere un millilitro del buffer di carico nella colonna. Infine, spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Una rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso di microglia isolate da lesioni demielinizzanti di topi adulti prima e dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente è mostrata qui.
Le immagini grafiche rappresentano l'altezza di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione laterale per la selezione delle celle, l'area di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione in avanti per la selezione di celle singole e CD11b-FITC e CD45-APC per la selezione delle cellule mieloidi e delle microglia. La proporzione di microglia è aumentata significativamente dopo la selezione cellulare attivata magneticamente. L'immagine grafica rappresenta la strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso per singole cellule vive e morte dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente.
Qui, la 7-aminoactinomicina D e l'altezza di dispersione laterale sono state utilizzate per selezionare le cellule viventi. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di microdissettare con precisione le lesioni demielinizzanti sotto uno stereomicroscopio basato sui segni rossi neutri.
