Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Questo metodo può aiutare a rilevare la tossicità ossea indotta dalle sostanze chimiche nel pesce zebra. La colorazione rosso alizarina del tessuto fisso genera una registrazione permanente dei cambiamenti scheletrici che può facilitare il confronto di diversi campioni. Questa tecnica potrebbe essere utile per studiare l'osteoporosi nel modello zebrafish, poiché una delle caratteristiche dell'osteoporosi è la diminuzione della massa ossea.

Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a nove giorni dopo la fecondazione e fissare il pesce in un millilitro di aldeide paraforme al 2% e 1X PBS per due ore. Decantare la soluzione e lavare la larva di zebrafish usando 100 millimolari Tris HCL con un pH di 7,5 o 10 millimolari di cloruro di magnesio. Per decolorare, decantare la soluzione e incubare la larva per cinque minuti in una serie di soluzioni come descritto nel manoscritto.

Dopo l'incubazione finale, decantare la soluzione e rimuovere il pigmento sbiancando con una soluzione composta da perossido di idrogeno al 3% e idrossido di potassio allo 0,5%. Osservare una volta ogni 10 minuti fino a quando il pigmento non viene completamente rimosso. Risciacquare la larva di zebrafish più volte con glicerina al 25%, idrossido di potassio allo 0,1% per 10 minuti ciascuno fino a quando non ci sono bolle.

Macchia nella larva immergendo in un millilitro di 0,01% di alizarina. Decantare la soluzione e aggiungere un millilitro di glicerina al 50% o idrossido di potassio allo 0,1% per cancellare lo sfondo. Conservare il pesce in 50% di glicerina fresca o idrossido di potassio allo 0,1% per la successiva osservazione.

Trasferire una larva alla volta sul vetrino mantenendo la larva al centro della goccia di liquido. Osserva la larva sotto uno stereomicroscopio. Accendere la fotocamera.

Aprire il software e mantenere le impostazioni predefinite. Clicca su AE e scegli un tempo di esposizione appropriato per ottenere l'immagine migliore. Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni.

Salvate le immagini in formato dot tiff per un'analisi successiva. Fare doppio clic sull'icona imageJ. Per analizzare le immagini salvate, fare clic su file, quindi aprire, quindi fare clic sull'immagine, quindi digitare e selezionare otto bit.

Fare clic su modifica e invertire. Fare clic su Analizza, quindi calibrare. Selezionare OD non calibrato nell'interfaccia pop-up.

Controllare la calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK. Fare clic su analizza, impostare la scala, quindi rimuovere la scala. Controlla globale di seguito e fai clic su OK.

Fare clic su analizza, quindi impostare le misurazioni. Seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia pop-up. Controllare il limite alla soglia riportato di seguito per misurare solo l'intervallo selezionato e fare clic su OK.

Fai clic sull'immagine, regola, quindi sulla soglia e fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia pop-up. Selezionare la soglia appropriata in modo che vengano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine. E fai clic su imposta.

Fare clic su analizzare, quindi misurare, salvare le date. La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. A nove giorni dalla fecondazione, molte ossa dello scheletro della testa come parasfenoide, opercolare, ceratobranchiale e notocorda sono mineralizzate e quindi colorate di rosso.

Al contrario, le strutture non ossee come gli otoliti, appaiono marrone nero. L'analisi digitale eseguita per quantificare l'area totale colorata, ha mostrato una significativa diminuzione dell'area colorata per i gruppi di trattamento con acetato di piombo da 10 e 20 milligrammi per litro. I cambiamenti nella mineralizzazione ossea hanno mostrato una dipendenza dalla dose.

Per un migliore effetto di colorazione e osservazione, è importante rimuovere il pigmento originale delle larve di zebrafish e rimuovere le bolle dopo lo sbiancamento.