Questo protocollo descrive un metodo semplice e rapido per misurare la funzione mitocondriale del tumore. Il protocollo è ampiamente applicabile all'oncologia clinica traslazionale e contribuirà a migliorare l'interpretazione diagnostica e meccanicistica del ruolo dei mitocondri nell'insorgenza e nella progressione del cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'applicazione dell'omogeneizzazione tissutale per semplificare la preparazione e massimizzare la resa dei mitocondri mitigando i limiti di diffusione.
Questa tecnica offre potenziali applicazioni in contesti clinici e diagnostici con una valutazione quantitativa della funzione mitocondriale tumorale utilizzando tessuto tumorale appena sottoposto a biopsia o asportato. Inizia posizionando un omogeneizzatore di vetro contenente un millilitro di mezzo respiratorio mitocondriale, o MiR05, in un pestello di vetro aderente su ghiaccio bagnato. Posizionare il tessuto in un millilitro di soluzione di conservazione della biopsia, o BIOPS, in una capsula di Petri ghiacciata.
Tagliare il tumore in piccoli pezzi di circa 5-10 milligrammi ciascuno e rimettere i restanti pezzi di tumore in 10 millilitri di BIOPS tenuti sul ghiaccio. Dopo aver tamponato accuratamente le sezioni di tessuto su una carta da filtro, posizionarle su una piccola barca di plastica catramata e registrare il peso umido iniziale. Riposizionare i pezzi inutilizzati nel tubo conico da 10 millilitri di BIOPS per una conservazione continua.
Immergere le sezioni di tessuto in un omogeneizzatore ghiacciato contenente MiR05 e registrare il peso rimanente sulla barca di pesatura. Utilizzando un pestello di vetro con un intervallo di gioco da 0,09 a 0,16 millimetri, interrompere delicatamente il tessuto tumorale completando da cinque a sette colpi verso il basso e verso l'alto. Per ogni colpo, ruotare il pestello con un movimento in senso orario / antiorario tre volte mentre si spinge il pestello verso il basso e altre tre volte mentre si tira indietro il pestello.
Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo dell'omogeneizzatore tra un colpo e l'altro, ma evitare di portare il pestello completamente al di sopra del volume del fluido per evitare la formazione di schiuma. Versare l'omogeneizzato in un tubo conico da 15 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Pipettare da uno a tre millilitri di MiR05 fresco sopra il pestello e nell'omogeneizzatore per lavare l'omogeneizzatore di tessuto rimanente.
Versare il lavaggio MiR05 nel tubo conico contenente l'omogeneizzato. Ripetere questo passaggio due o tre volte per garantire il trasferimento completo dell'omogeneizzato. Per calcolare con precisione la concentrazione di omogeneizzato tissutale, ispezionare attentamente l'omogeneizzatore e l'omogeneizzato per il materiale non omogeneizzato rimanente, che include il tessuto connettivo.
Per rimuovere dall'omogeneizzatore il materiale non omogeneizzato che non può essere raggiunto con una pinzetta, dopo aver aggiunto MiR05 all'omogeneizzatore, aspirare il volume, compreso il tessuto, con una pipetta e spostare il contenuto in una capsula di Petri. Rimuovere l'omogeneizzato del materiale non omogeneizzato sistemato in pezzi di grandi dimensioni sul fondo del tubo conico aspirandoli con una pipetta e posizionarli sul cappuccio del tubo conico. Rimuovere il fazzoletto dalla capsula di Petri o dal cappuccio del tubo conico con una pinzetta e tamponarlo su carta da filtro.
Aggiungere l'omogeneizzato rimanente dal cappuccio del tubo conico nel tubo conico. Tappare il tubo, quindi invertire per mescolare. Ispezionare nuovamente gli omogeneizzatori e l'omogeneizzatore per qualsiasi materiale aggiuntivo non omogeneizzato e ripetere i passaggi per rimuovere il materiale non omogeneizzato, se necessario.
Pesare e registrare la massa del materiale non omogeneizzato recuperato dall'omogeneizzatore. Ispezionare la preparazione omogenea per qualsiasi tessuto grossolanamente intatto trasferito e rimuovere i pezzi non omogeneizzati e pesare se necessario. Sottrarre il peso del tessuto recuperato dalla barca di pesatura, dall'omogeneizzatore e dall'omogeneizzatore dal peso umido iniziale per calcolare il peso finale del campione.
Utilizzando il peso finale del campione, aggiungere ulteriore MiR05 per portare l'omogeneizzato alla concentrazione desiderata. Una volta che l'omogeneizzato è stato pesato e preparato, procedere al test il prima possibile. Conservare il campione conservato su ghiaccio bagnato fino a quando non viene trasferito allo strumento.
Una volta calibrato lo strumento e preparato il campione, rimuovere i tappi con un movimento di torsione e aspirare il MiR05 dalle camere, evitando la membrana esposta all'interno della camera. Mescolare bene l'omogeneizzato e aggiungere 2,25 millilitri di omogeneizzato alla camera. Supponiamo che un omogeneizzato venga aggiunto a più camere, pipettare un millilitro dell'omogeneizzato alla volta in ogni camera mentre si mescola l'omogeneizzato per garantire un'equa distribuzione tissutale.
Fare clic su F4 per assegnare un nome e un timestamp all'evento, quindi fare clic su OK. Riempire una siringa da 50 millilitri con ossigeno da un serbatoio di ossigeno con un regolatore e un tubo del gas usando un ago smussato da 18 calibri. Iniettare l'ossigeno direttamente nelle camere per iperossigenarle a circa 500 micromolari di ossigeno.
Inserire liberamente i tappi e attendere che si chiudano fino a quando l'ossigeno raggiunge circa 480 micromolari. Con un movimento di torsione, chiudere lentamente la camera e lasciare che la respirazione si equilibri per circa 15-20 minuti. Riempire il capillare centrale del tappo con MiR05, se necessario.
Utilizzare microsiringhe dedicate per iniettare substrati, disaccoppiatori e inibitori in camere completamente chiuse per nominare e marcare il timestamp degli eventi per ciascuna camera in tempo reale. Selezionare F6 per regolare la concentrazione di ossigeno e le scale negative della pendenza dell'ossigeno in base alle esigenze. Dopo ogni iniezione, lavare la siringa tre volte in acqua per i composti solubili in acqua e il 70% di etanolo per i composti disciolti dall'etanolo.
Aggiungere cinque microlitri di malato 0,8-molare e procedere immediatamente all'iniezione successiva. Lavare la siringa per iniezione tre volte in acqua. Aggiungere immediatamente cinque microlitri di piruvato 1-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi.
Dopo aver lavato la siringa, aggiungere 10 microlitri di ADP 0,5 molare e attendere che la risposta ADP si stabilizzi. Lavare la siringa e aggiungere cinque microlitri di glutammato 2-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa, quindi aggiungere cinque microlitri di citocromo C 4 millimolare e attendere che la respirazione si stabilizzi.
Dopo aver lavato la siringa, aggiungere 20 microlitri di succinato 1-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Titolare incrementi da 0,5 a 1 microlitro di FCCP da 1 millimolare e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione. Continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione.
Lavare la siringa per iniezione tre volte con etanolo al 70%. Aggiungere due microlitri di rotenone 150-micromolare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere un altro microlitro di rotenone per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione.
Se c'è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione, quindi lavare la siringa per iniezione tre volte con etanolo al 70%. Aggiungere due microlitri di antimicina A 125 micromolare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere un altro microlitro di antimicina A per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione.
Se c'è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione. Lavare la siringa tre volte con il 70% di etanolo. Controllare la concentrazione di ossigeno della camera.
Se la concentrazione è inferiore a 125 micromolari, riossigenare all'aria ambiente o leggermente iperossigenato per garantire che l'ossigeno non limiti il flusso respiratorio. Aggiungere cinque microlitri di ascorbato 0,8 molare. Lavare la siringa tre volte con etanolo al 70%.
Aggiungere immediatamente 10 microlitri di TMPD 0,2 molari e attendere un aumento della respirazione. Dopo aver lavato la siringa con etanolo, aggiungere immediatamente 25 microlitri di azide di sodio 4-molare quando il flusso respiratorio dell'ascorbato TMPD si stabilizza. Termina il facendo clic su File, Salva e disconnetti.
È stato osservato che 40 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale hanno provocato un rapido esaurimento di ossigeno. Il consumo di ossigeno è rallentato sostanzialmente con 30 e 20 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale, ma è comunque diminuito rapidamente in breve tempo in assenza di substrati o ADP. La concentrazione di 10 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale ha determinato il tasso ottimale di consumo di ossigeno.
Un protocollo SUIT è stato utilizzato per valutare la fosforilazione ossidativa legata al NADH e al succinato e il trasferimento di elettroni, nonché l'attività del complesso IV. Il rilascio di citocromo C è stato valutato in presenza di piruvato e malato, o succinato e rotenone, entrambi i quali hanno rivelato che il preparato di omogeneizzato non danneggiava i mitocondri. È stato anche scoperto che la fosforilazione ossidativa legata al NADH era trascurabile nei tumori EO771.
La titolazione di FCCP per guidare il flusso massimo di elettroni ha rivelato che nei tumori EO771, la fosforilazione, piuttosto che l'ossidazione, era limitante alla respirazione. I profili respiratori omogeneizzati tumorali erano simili a quelli delle cellule EO771 non impiantate, permeabilizzate alla digitonina, ad eccezione del ridotto trasferimento massimo di elettroni supportato da substrati legati a N e S nel tumore. La cinetica respiratoria del succinato è stata ulteriormente valutata mediante titolazioni graduali di ADP subsaturo fino al raggiungimento della velocità massima.
La concentrazione semi-massimale di ADP in presenza di succinato e rotenone era di 37,5 micromolari, mentre la velocità massima era di circa 10,5 picomoli al secondo, per milligrammo. Gli strumenti installati nella cura di routine, così come la gestione dei tessuti, sono di fondamentale importanza per il successo di questi esperimenti. Seguendo queste procedure, altri approcci specifici di massa o marcatore per la normalizzazione dei tassi possono essere applicati in base alla questione dell'interesse.
Le misure comuni includono la quantificazione totale delle proteine e l'attività enzimatica della citrato sintasi, ma variano in base al sistema modello, al disegno statistico e alla domanda di ricerca.
