L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'integrazione di tre sistemi di imaging in un unico dispositivo, che consente una misurazione simultanea della funzione meccanica, della dinamica ionica e del cambiamento geometrico del tessuto cardiaco contraente. In particolare, misuriamo la produzione di forza del tessuto, i transitori di calcio, gli spostamenti locali e il cambiamento di forma. La combinazione di queste modalità di imaging può aiutare a rispondere a domande chiave nelle malattie cardiache, con importanti implicazioni per lo sviluppo di strategie di trattamento efficaci.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di studiare l'eterogeneità dell'attività muscolare. Il dispositivo utilizzato in questo protocollo contiene tre sistemi di imaging in grado di eseguire l'imaging dello stesso campione, un microscopio a campo luminoso, un microscopio a fluorescenza e un tomografo a coerenza ottica. Una serie di specchi dicroici vengono utilizzati per separare l'emissione di fluorescenza e l'immagine di trasmissione in campo luminoso.
Le caratteristiche fondamentali di questo dispositivo sono due ganci di montaggio ad azionamento indipendente, una camera di misura con tre assi otticamente chiari e una linea di trigger esterna che sincronizza le telecamere brightfield e OCT con uno stimolatore. In questo video, dimostriamo come isolare, preparare e immaginare le trabecole cardiache e presentare alcuni risultati rappresentativi. Dopo aver espulso un cuore da un ratto anestetizzato, trasferirlo nella camera di dissezione.
Usando due pinca curva, tirare l'aorta sulla cannula di perfusione. Tenere l'aorta in posizione con un forcep. Nel frattempo, aprire la linea del tubo per consentire alla soluzione di dissezione di fluire attraverso la cannula di perfusione.
Una volta che la vascolarizzazione coronarica è stata ripulita dal sangue e il cuore è completamente perfuso con soluzione di dissezione, fissare l'aorta in posizione usando una sutura. Posizionare il cuore ruotando la cannula in modo che l'arteria coronaria sinistra sia visibile sulla superficie superiore. Fissare l'apice del cuore sul fondo della camera di dissezione.
Taglia entrambi gli atri. Tagliare lungo il lato destro del setto fino all'apice del cuore. Fissare il ventricolo sinistro aperto alla base della camera di dissezione.
Quindi, tagliando lungo il lato sinistro del setto, apri il ventricolo destro e fissalo anche alla base della camera di dissezione. Identificare una trabecola a corsa libera nel ventricolo destro. Usando le forbici a molla e un forcep, tagliare il tessuto murario che circonda la trabecola.
Quindi, tagliare il tessuto della parete a metà, ortogonale alla direzione della trabecola. Tagliare il tessuto della parete fino a quando la sua dimensione è appropriata per la configurazione di montaggio utilizzata. Lasciare la trabecola asportata nella camera di dissezione.
Sciacquare l'acqua calda, l'acqua distillata e quindi infondere la soluzione attraverso la camera di misurazione. Accendere la sorgente luminosa del microscopio a campo luminoso e premere F1 per consentire l'acquisizione. Regolare manualmente il gancio a valle fino a quando non è centrato nell'immagine in campo luminoso.
Fare clic sull'asse zero a valle, quindi su disattivazione a valle per abilitare il motore. Spostate il dispositivo di scorrimento del setpoint a valle fino a quando la fine del gancio non si allinea con lo spigolo dell'area di interesse predefinita. Azzerare nuovamente l'asse a valle, quindi spostare il dispositivo di scorrimento del setpoint a valle su 1.000.
Ripetere il processo con il gancio a monte, ma non spostare il dispositivo di scorrimento del setpoint a monte dopo aver azzerato nuovamente l'asse a monte. Fare clic su Sposta su montaggio. Avviare il sistema di illuminazione a fluorescenza attivando l'interruttore della lampada prima di accendere rapidamente i sottosistemi del controller attivando l'interruttore principale.
Passare la modalità operativa al turbo blanking premendo il pulsante della modalità sul pannello frontale, seguito da due, quindi uno. Premere il pulsante online per abilitare il controllo esterno. Mettere in pausa il flusso superfusato attraverso la camera di misurazione.
Riempire la camera di montaggio con soluzione di dissezione. Utilizzando una siringa da un millilitro, trasportare la trabecola dalla camera di dissezione alla camera di montaggio. Lasciare che la trabecola scenda nella camera di montaggio per gravità.
Abbassare il livello del fluido nella camera di montaggio in modo che sia a livello della sezione centrale dei ganci. Regolare la distanza tra i ganci per riflettere la lunghezza lenta della trabecola spostando il cursore del setpoint a valle. Usando un microscopio per facilitare la visualizzazione, afferra leggermente uno dei pezzi di tessuto finale con una pinca e montalo sul gancio a monte.
Montare l'altro pezzo di tessuto finale sul gancio a valle. Una volta montato in modo sicuro, spostare nuovamente la trabecola nella camera di misura premendo sposta su camera e riprendere il flusso di superfusato. Imposta la frequenza dello stimolo su uno, la durata dello stimolo su 10 e la tensione dello stimolo su 10.
Inizia la stimolazione premendo lo stimolo. Accendere il sistema di illuminazione a campo luminoso. Premere F1 e selezionare un'area di interesse che racchiude un'area striata dell'interfaccia utente.
Fare clic su Calcola lunghezza sarcomero per calcolare la lunghezza media del sarcomero nell'area evidenziata. Aumentare la lunghezza muscolare fino a quando la lunghezza media del sarcomero è di circa 2,32 micron. Sposta il muscolo regolando il cursore del setpoint centrale sulla scheda di controllo del centro e della separazione in modo che il bordo del gancio a valle sia visibile all'interno dell'immagine in campo luminoso.
Raccogli le informazioni sulla fluorescenza per 10 contrazioni. Aumentare il valore del setpoint centrale di 200 e raccogliere altre 10 contrazioni di informazioni sulla fluorescenza. Ripetere questo processo fino a quando l'immagine brightfield contiene l'hook a monte.
Raccogli le informazioni sulla fluorescenza della finestra finale. Riportare la trabecola in posizione centrale impostando il valore del setpoint centrale su zero. Ridurre la frequenza di stimolo a 0,2 Hertz e passare dal superfusato K-H alla soluzione di carico Fura-2.
Misurare il segnale di fluorescenza ogni 10 minuti. Visualizza il segnale nella scheda del segnale PMT. Dopo che il segnale a 360 nanometri è aumentato di un fattore 10, restituire la frequenza di stimolo a un Hertz e tornare alla soluzione di superfusato K-H.
Controllare la misurazione del rapporto ogni 10 minuti fino a quando il segnale non si stabilizza, a quel punto può iniziare la raccolta dei dati. Riportare il muscolo nella posizione in cui il bordo del gancio a valle è appena presente all'interno dell'immagine in campo luminoso. Acquisire le informazioni sulla fluorescenza facendo clic su Abilita sorgente di fluorescenza.
Avviare lo streaming di dati hardware. Nell'interfaccia utente di imaging a campo luminoso, impostare la modalità di acquisizione su trigger esterno, aumentare la frequenza dei fotogrammi a 100 Hertz e impostare il numero di immagini da acquisire su 100. Premere control-shift-S, seguito da F1, per registrare i dati di imaging brightfield per questa finestra.
Aumentate il valore del setpoint centrale di 200 e ripetete il processo di acquisizione del campo luminoso. Continuare con il protocollo di scansione fino a quando i dati di imaging non sono stati raccolti per la finestra finale. Riportare la trabecola in posizione centrale impostando il valore del setpoint centrale su zero.
Accendere la sorgente di illuminazione dello Strumento di personalizzazione di Office ruotando il tasto master, premendo il pulsante di accensione, seguito dal pulsante SD. Coprire la testa del galvanometro e fare clic su Ottieni sfondo per misurare il modello di interferenza di sfondo e sottrarlo dalla misurazione. Impostare la modalità di acquisizione dell'immagine su Live View.
Centrare la trabecola negli assi X e Y regolando i valori di offset X e Y. Con la trabecola centrata, scansiona lungo l'asse y regolando la posizione Y per trovare le posizioni corrispondenti ai ganci a monte e a valle. Annotare queste posizioni verso il basso.
Impostare l'intervallo Y sulla differenza assoluta tra questi valori divisa per 10. Impostare la modalità di acquisizione dell'immagine su stimolo attivato, intervallo da X a 100 e fare clic sul pulsante Imposta parametri attivi. Fai clic su Flussi di dati, quindi acquisisci.
Al fine di catturare le informazioni regionali sul calcio e sul campo luminoso per l'intera lunghezza della trabecola qui presentata, sono state necessarie sette posizioni muscolari. Questa cifra della forza media da ciascuna delle posizioni sovrapposte suggerisce che la forza di contrazione era indisturbata da questo movimento, rivelando che non c'era dipendenza dalla posizione dell'atto di produzione della forza. Queste scansioni raccolte utilizzando la tomografia a coerenza ottica ad una velocità di 100 Hertz sono state segmentate utilizzando il plugin ImageJ, Weka.
Ogni sezione trasversale appare distorta a causa della differenza tra le risoluzioni laterale e di profondità. Questo è stato corretto ridimensionando ciascun asse in modo indipendente con la rispettiva risoluzione. Dopo aver ridimensionato la scansione C grezza della trabecola, il muscolo è approssimativamente cilindrico.
Il riflesso della parete della camera di misura a volte può sovrapporsi ai dati muscolari, ma il software di segmentazione può essere addestrato per tenere conto di questo. Una volta segmentato, l'area della sezione trasversale lungo la lunghezza del muscolo può essere calcolata durante la contrazione. Si noti che questa particolare trabecola ha un piccolo ramo.
Il moto del ramo è evidente approssimativamente a metà della trabecola. Infine, le immagini segmentate possono essere convertite in mesh per aiutare la costruzione di modelli geometrici. I dati di imaging acquisiti in ciascuna delle sette posizioni ad una velocità di 100 fotogrammi al secondo sono stati cuciti insieme per creare un'unica immagine completa della trabecola.
Il rapporto tra la fluorescenza omessa associata alla luce di eccitazione a 340 e 380 nanometri è correlato al calcio intracellulare dopo che la trabecola è stata caricata con Fura-2. La media di 10 transienti di calcio intracellulare da ogni finestra sono allineati con la regione in cui sono stati ripresi. Mentre il picco dei transitori per questa trabecola appare ragionevolmente consistente, il calcio diastolico ridotto lungo la sua lunghezza.
Allo stesso modo, i risultati del tracciamento dello spostamento e dei calcoli della lunghezza del sarcomero indicano anche la presenza di variabilità regionale. La tecnica di tracciamento senza marcatori utilizzata è in grado di calcolare lo spostamento di ciascun pixel. L'idoneità delle stime di lunghezza del sarcomero è stata testata in base alla larghezza e all'ampiezza dell'adattamento gaussiano al segnale FFT.
Queste condizioni non erano soddisfatte nella regione muscolare tra zero e 500 micron, quindi non è stato possibile calcolare alcuna informazione sulla lunghezza del sarcomero. Dati gli spostamenti associati, è probabile che i sarcomeri in questa regione si siano allungati durante la fase contrattile della contrazione. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le trabecole cardiache e prepararle per l'imaging multimodale in modo affidabile.
Questo processo stabilisce un percorso per la raccolta di un set di dati necessario per la costruzione di modelli agli elementi finiti fisiologicamente informati della contrazione del tessuto cardiaco.
