Il virus dell'herpes simplex oncolitico è una forma emergente di immunoterapia oncologica. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione titerica dei virus è fondamentale per l'uso in studi sperimentali. Questo metodo è molto semplice e può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio di livello di biosicurezza due per ricevere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.
La produzione di uno stock virale puro e di alta qualità è fondamentale poiché viene utilizzato per studiare la risposta immunitaria antitumorale e sviluppare una nuova forma di immunoterapia oncologica a base di virus. Questo protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi virus simplex di herpes di tipo selvatico o geneticamente modificato. Questo protocollo dovrebbe essere facile da leggere e facile da seguire per un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica prima.
I materiali e i reagenti elencati devono essere in posizione prima di provare questa tecnica per la prima volta. Inizia lavando i mazzi T-150 di centimetri quadrati con DPBS di glucosio due volte alto integrato con 1%IFCS. Aspirare il DPBS e aggiungere sette millilitri di virus inoculo per pallone.
Dondolare delicatamente i mazzi per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius per 1,5-2 ore. Quindi, rimuovere l'inoculo e aggiungere 25 millilitri di DMEM integrati con 1%IFCS a ciascun pallone. Dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per due o quattro giorni, raccogliere 20 millilitri del supernatante di coltura da ogni pallone in tubi di centrifuga da 50 millilitri.
Utilizzando un raschietto per cellule, raschiare le cellule dal fondo dei contenitori. Aggiungere circa 15 millilitri del supernatante di coltura precedentemente raccolto a ciascun pallone per portare il volume a 20 millilitri, quindi utilizzare una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri per lavare delicatamente il fondo dei contenitori alcune volte. Raccogliere le cellule con mezzi in tubi di centrifuga conica da 50 millilitri posti sul ghiaccio.
Centrifugare i tubi a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resuspend ogni pellet accuratamente in 1,25 millilitri di tampone virale, o VB, e 1,25 millilitri di supernatante di coltura precedentemente raccolto. Mescolare tutti i pellet rimorsi in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri.
Snap congelare le cellule rimorsidenti usando ghiaccio secco e 100% etanolo e conservare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare le cellule congelate precedentemente spezzate in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius e sonicare per un minuto per tre cicli in un bagno d'acqua. Aggiungere 175 unità di Benzonasio Nucleasi e due microlitri di due cloruri millimolari di magnesio per millilitro del litorato cellulare e del vortice.
Dopo un'incubazione di 30 minuti e un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius, posizionare il tubo sul ghiaccio. Ruotare la lire cellulare a 300 volte G per 10 minuti. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 millilitri e rimescolare il pellet cellulare in 500 microlitri di VB. Designarlo come pellet uno.
Ruotare nuovamente il supernatante raccolto a 500 volte G per 10 minuti e conservare il supernatante separatamente in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri da utilizzare in seguito. Rimorsi il pellet cellulare in 500 microlitri di VB, designarlo come pellet due. Unire il pellet rimorsinato uno e pellet due in un nuovo tubo di centrifuga e vortice da 1,75 millilitri e sonicare due volte in un bagno d'acqua prima di girare i tubi a 400 volte G per 10 minuti.
Raccogliere il supernatante dal tubo di centrifuga da 1,7 millilitri e combinarlo con il tubo di centrifuga conico da 50 millilitri precedentemente raccolto. Filtrare il supernatante attraverso un filtro sterile a membrana PVDF da cinque micrometri in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri chiamato tubo uno. Aggiungere un millilitro di VB al tubo di centrifuga da 50 millilitri, svuotato dopo aver filtrato il supernatante dal passo precedente, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro a membrana PVDF posto sul tubo uno.
Passare il filtrato dal tubo uno attraverso un filtro sterile a membrana MCE da 0,8 micrometri posto su un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri chiamato tubo due. Aggiungere un millilitro di VB al tubo svuotato uno, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro MCE posto sul tubo due. Passare il filtrato dal tubo due attraverso un filtro PVDF sterile da 0,45 micrometri posto su un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri etichettato tubo tre.
Come descritto in precedenza, ripetere il lavaggio del tubo due con un millilitro di VB per aggiungere filtrato al tubo tre. In questa analisi rappresentativa, l'effetto citopatico potrebbe essere osservato nelle cellule di Vero a 36, 48 e 72 ore dopo l'infezione da oHSV con l'arrotondamento delle cellule colpite. Il crescente livello di CPE nel tempo è evidente come visualizzato dall'espressione mCherry.
A 72 ore dall'infezione, le placche virali sono state macchiate di X-gal per visualizzare gli OHSV con espressione lacZ. Pulire delicatamente le cellule infettate dal virus e lavare delicatamente il fondo sul pallone è fondamentale per mantenere intatta tutta la cellula infetta HSV in modo da ottenere un elevato stock virale di formicolio.
