Questo protocollo espone le cellule tumorali in una sospensione a brevi impulsi di stress da taglio fluido per imitare alcuni aspetti di come le cellule tumorali metastatiche sono esposte alle forze emodinamiche mentre sono nel sistema circolatorio. Ă una tecnica relativamente semplice per applicare brevi impulsi di stress da taglio del fluido di alto livello. Quando si tenta questo protocollo, fare attenzione agli aghi non tappati e non piegarli in quanto ciĂČ cambierĂ lo sforzo di taglio della forza applicato.
Questa procedura puĂČ produrre aerosol, quindi utilizzare misure di sicurezza appropriate. Per iniziare, rilasciare dal 70 al 90% di cellule PC3 confluenti dal piatto di coltura tissutale aspirando il mezzo di crescita e lavando il piatto da 10 centimetri con cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio. Quindi, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di 0,25% tripsina.
Post-tripsinizzazione, osservare il distacco delle cellule al microscopio invertito. Per inibire la tripsina, aggiungere cinque millilitri di mezzo DMEM/F12 contenente il 10% di FBS. Quindi, posizionare la sospensione cellulare in un tubo conico e determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule.
Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per tre minuti, quindi aspirare il surnatante e ricasegare il pellet in un terreno di coltura tissutale privo di siero. Tagliare intorno al fondo del tubo di polistirene da 14 millilitro sulla linea dei sette millilitro e posizionare la sospensione a celle miste nel tubo tagliato. Raccogliere separatamente campioni di controllo statico delle cellule prima dell'esposizione allo stress da taglio del fluido da utilizzare per l'esecuzione di saggi.
Per esporre il campione di sospensione cellulare rimanente allo stress di taglio del fluido, aspirare la sospensione cellulare in una siringa da cinque millilitri e collegare un ago da mezzo pollice da 30 gauge. Posizionare e fissare la siringa con un ago non tappato su una pompa a siringa e impostare la portata per raggiungere il livello desiderato di sforzo di taglio del fluido. Eseguire la pompa della siringa e raccogliere il campione tranciato nel tubo tagliato con un angolo di circa 45 gradi per ridurre la formazione di schiuma.
Rimuovere con cautela la siringa dalla pompa della siringa e utilizzare le pinze per rimuovere l'ago, facendo attenzione a non toccarlo. Ripetere la procedura fino a quando la sospensione cellulare non Ăš stata esposta al numero desiderato di impulsi di sforzo di taglio del fluido. Eseguire saggi di vitalitĂ con i campioni statici prima di esporre le cellule allo stress di taglio del fluido.
Per i saggi enzimatici, trasferire aliquote di 100 microliti dai campioni statici in duplice copia in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, raccogliere 100 microlitri di campioni dopo l'esposizione allo stress da taglio del fluido e posizionarli in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di una soluzione di resazurina da 0,15 milligrammi per millilitro a ciascun pozzetto del campione e ai pozzetto contenenti 100 microlitri di solo mezzo.
Incubare le piastre del pozzo nell'incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per due ore, quindi misurare la fluorescenza e l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre e ottenere la percentuale di cellule vitali confrontando il segnale medio da ciascuno dei campioni esposti allo stress di taglio del fluido con il campione di controllo medio a statico. Allo stesso modo, raccogliere aliquote da campioni statici per eseguire citometria a flusso e saggi clonogenici come descritto nel manoscritto di testo. Nell'analisi rappresentativa, la vitalitĂ delle cellule tumorali epiteliali mammarie della biopsia singeneica Ăš stata valutata utilizzando la conversione della resazurina dopo aver esposto le cellule a una serie di impulsi di stress da taglio fluido.
Anche se ogni linea cellulare mostrava diversi profili di resistenza, non vi era alcuna differenza significativa nella vitalitĂ dopo 10 impulsi di esposizione allo stress da taglio del fluido. Ulteriori linee cellulari tumorali da una varietĂ di origini tissutali hanno dimostrato la vitalitĂ di oltre il 20% dopo 10 impulsi di stress da taglio fluido, ad eccezione delle cellule MIA PaCa-2, che hanno mostrato una vitalitĂ inferiore al 10% a causa della sensibilitĂ verso la distruzione meccanica da stress da taglio fluido. Quando si raccoglie il campione statico prima di applicare lo sforzo di taglio dei fluidi, assicurarsi che la sospensione cellulare sia omogeneamente miscelata.
Rimuovere con attenzione l'ago con una pinza e non piegare o toccare l'ago. Oltre a misurare la vitalitĂ cellulare, si possono valutare i cambiamenti nell'espressione genica, nella segnalazione cellulare, nella proliferazione e nella migrazione. Usando questo come modello di esposizione allo stress da taglio fluido, si puĂČ studiare sia come le cellule tumorali resistono alla distruzione da parte dello stress da taglio fluido sia valutare gli effetti dello stress da taglio fluido sulla biologia delle cellule tumorali.
Questa tecnica Ăš stata utilizzata dal nostro laboratorio e da altri per esplorare gli effetti dello stress da taglio fluido sulle cellule tumorali circolanti. Questi studi hanno dimostrato che lo stress da taglio del fluido altera rapidamente le proprietĂ meccaniche delle cellule tumorali e che ciĂČ contribuisce alla capacitĂ delle cellule tumorali di resistere alla distruzione da parte dello stress da taglio del fluido.
