Il metodo delle fette polmonari tagliate con precisione preserverà la struttura e gli orientamenti spaziali in tre dimensioni senza pregiudizi regionali e può servire come modello surrogato dal vivo per le misurazioni della contrattilità dei vasi e delle vie aeree. In combinazione con l'imaging time-lapse, il Western blot e l'analisi dell'RNA, le fette polmonari tagliate con precisione contribuiscono alla comprensione completa delle cascate di segnalazione che sono alla base di un'ampia varietà di disturbi e portano a una migliore comprensione della fisiopatologia nelle malattie vascolari polmonari. Per iniziare, posiziona il topo adulto eutanasizzato in posizione supina e fissalo in posizione attaccando le zampe e il naso al tavolo con nastro adesivo.
Spruzzare la superficie ventrale del mouse con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza per sollevare la pelle addominale del topo nella posizione della vescica e forbici chirurgiche per tagliare la linea mediana, spostandosi superiormente alla regione cervicale per esporre la trachea. Quindi utilizzare una pinzetta per sollevare lo strato fasciale sottostante e utilizzare forbici chirurgiche per esporre gli organi viscerali e il compartimento mediastinico, tagliando di nuovo da inferiore a superiore.
Tagliare lo sterno sulla linea mediana per esporre il cuore e il polmone. Sezionare attentamente il diaframma dal fegato e dal compartimento addominale. Individuare la vena cava inferiore sotto l'intestino e tagliarla.
Dopo aver individuato il ventricolo destro, utilizzare un ago a farfalla da 25 a 30 gauge per iniettare 0,5 millilitri di eparina frazionata all'1% nel ventricolo destro e sciacquarlo lentamente ma costantemente con 10-15 millimetri di PBS. Dopo aver localizzato la laringe, utilizzare una pinzetta a punta smussata per sezionare la fascia e il tessuto circostanti, quindi posizionare la sutura chirurgica sotto la trachea e legare liberamente un nodo chirurgico. Posizionare un piccolo foro nella trachea superiore alla corda e cannulare con un ago smussato calibro 20.
Stringere la sutura attorno all'ago e alla trachea usando un nodo chirurgico. Quindi iniettare da 2,5 a 4 millilitri di agarose nella trachea e monitorare l'inflazione del polmone. Dopo l'iniezione di agarose, versare PBS freddo sul polmone per solidificare l'agarose.
Quindi tagliare la trachea superiore alla sutura chirurgica e sezionare il polmone e il cuore dal mediastino rimuovendo eventuali aderenze e fascia. Dopo la solidificazione, posizionare il tessuto in DMEM in una capsula di Petri su ghiaccio e procedere immediatamente a affettare un lobo usando una macchina a vibratomo. Per preparare le fette polmonari, attaccare il campione alla piattaforma con supercolla, mantenendo il lato mediale rivolto verso l'alto.
Quindi riempire il contenitore del campione con PBS. Riempire il contenitore con ghiaccio per mantenere il PBS circostante e il campione freddo. Accendere il vibratoma.
Regolare lo spessore a 300 micrometri, la frequenza a 100 Hertz, l'ampiezza a 0,6 millimetri e la velocità a cinque micrometri al secondo. Utilizzando una chiave a brugola, ruotare il supporto della lama nella posizione sicura e aprire le ganasce per inserire una lama. Quindi stringere le mascelle con una chiave a brugola.
Posizionare il campione sulla scatola, assicurandosi che sia immerso in PBS. Fai scorrere la scatola nella posizione corretta e assicurati che sia sicura. Ruotare il supporto della lama nella posizione appropriata per l'affettatura.
Portare la lama del vibratomo fino al bordo del blocco e abbassare manualmente la lama fino a quando non è uniforme con la parte superiore del campione. Confermare le impostazioni ed eseguire il vibratoma. Dopo che le fette fresche sono state tagliate, rimuovere i campioni dal PBS e metterli in una capsula di Petri sterile con 10 millilitri di DMEM contenente antibiotico antimicotico una tantum.
Dopo aver posto tutte le fette in una capsula di Petri, ritrarre completamente la lama e utilizzare la chiave a brugola per sollevare la lama in una posizione sicura. Conservare i campioni in DMEM a 37 gradi Celsius. E posiziona una fetta di vibratoma su un vetrino per microscopio.
Utilizzare una salvietta detergente per rimuovere il mezzo in eccesso. Posizionare il campione sulla microscopia a contrasto di fase e utilizzare l'ingrandimento da 10 a 20X per identificare un vaso. Quindi aggiungere 500 microlitri di vasocostrittori, come il cloruro di potassio 60 millimolare o un'endotelina micromolare-1 per immergere completamente il vetrino.
Osserva e cattura il video registrando per 30-60 secondi. Prima di iniziare l'esperimento, riempire una piccola scatola di polistirene espanso con un litro di azoto liquido e posizionare due tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri nel contenitore con azoto liquido. Mettere da quattro a cinque fette di vibratome fresco in una ciotola di mortaio.
Versare da 5 a 10 millilitri di azoto liquido sopra le fette e utilizzare rapidamente il pestello per macinare le fette in polvere prima che l'azoto liquido evapori. Utilizzare uno scooper da laboratorio in acciaio pre-refrigerato per raccogliere la polvere nei due tubi di microcentrifuga refrigerati e lisi della polvere aggiungendo 500 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA per l'isolamento dell'RNA o 500 microlitri del tampone RIPA per la lisi proteica. Nell'esperimento di vitalità rappresentativa, il cambiamento di colore delle fette PCLS è stato rilevato dal giorno zero a uno e dal giorno nove al 10.
La soluzione era inizialmente blu e divenne rosa durante la notte, dimostrando vitalità. Il cambiamento di colore si verifica in genere entro una o quattro ore, ma potrebbe essere necessario un tempo più lungo. La differenza giornaliera tra l'assorbanza a 562 e 613 nanometri di lunghezze d'onda per il tessuto preparato al vibratome è mostrata qui.
La costrizione della vascolarizzazione in un tessuto polmonare preparato con vibratome usando endotelina-1 e cloruro di potassio può essere visualizzata qui. La conservazione dell'etichettatura di tdTomato nelle cellule una settimana dopo l'iniezione di tamoxifene è dimostrata in queste fette polmonari. È molto importante eseguire bene la fase di compensazione polmonare e di gonfiaggio per rimuovere tutto il sangue dalla circolazione prima di ulteriori esperimenti e imaging.
Oltre alle malattie vascolari, la PCLS può essere applicata per studiare la fisiobiologia delle malattie correlate alle vie aeree e può essere ulteriormente testata sui tessuti polmonari umani in scenari clinicamente rilevanti.
