Questo protocollo consente l'inoculazione di vettori virali direttamente in piante di mais che possono essere facilmente applicate nella maggior parte delle impostazioni di laboratorio senza la necessità di costose attrezzature specializzate. L'inoculazione diretta elimina l'uso di un ospite alternativo come fonte di inoculo, risparmiando tempo e risorse. Questo metodo potrebbe essere applicato ad altri vettori virali, linee di mais e potenzialmente altre specie monocotiledoni.
Inizia piantando da 1 a 2 semi di mais nel terreno di coltura a base di torba in piccoli inserti posti all'interno di vassoi. Posizionare i vassoi in una camera di crescita sotto i giorni di 16 ore a 25 gradi Celsius e 8 ore di notte a 22-25 gradi Celsius, o in una serra a 22-25 gradi Celsius con giorni di 16 ore e notti di 8 ore. Innaffia regolarmente le piante e concima una volta alla settimana con 15-5-15 fertilizzanti liquidi a 330 parti per milione di concentrazione.
Preparare l'agrobatterio per iniezione inoculando il ceppo agrobatterico contenente il costrutto virale desiderato in mezzi LB con antibiotici. Quindi, incubare il pallone o i tubi a 28 gradi Celsius mentre si agita a 225 RPM per 24 ore. Il giorno successivo, pellettificare i batteri per centrificazione a 4.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente ed scartare il surnatante.
Quindi, lavare il pellet con un millilitro di acqua deionizzata. Sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di soluzione di solfato di magnesio da 10 millimolari e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Quindi regolarlo su 1.0.
Utilizzare piantine di mais da 4 a 7 giorni per l'iniezione di agrobatteri. Assemblare la siringa e l'ago. Iniettare delicatamente la sospensione batterica a 2-3 millimetri sopra il nodo coleoptilulare fino a riempire il coleoptile, o è visibile nella spirale, in attesa della fase di crescita delle piante.
Iniettare tutte le piantine e cambiare la siringa e gli aghi per iniettare ogni costrutto. Confermare l'infezione fenotipica osservando le lesioni dal silenziamento dei geni di controllo, la lesione mimica 22 o la fitoene desaturasi sulle foglie. Utilizzare un dispositivo di imaging a fluorescenza per lo screening rapido delle piante e la microscopia a fluorescenza per rilevare la presenza di espressione GFP.
Eseguire analisi di espressione genica per il rilevamento molecolare delle infezioni. Estrarre l'RNA totale dalle foglie di piante infette da 14 a 21 giorni dopo l'infezione e sintetizzare il cDNA del primo filamento come descritto nel manoscritto di testo. Eseguire la PCR della trascrittasi inversa per confermare l'infezione e determinare l'integrità del gene o il frammento genico di interesse utilizzando primer specifici progettati per diversi costrutti virali.
Visualizza il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% contenente una macchia di acido nucleico per determinare la presenza o l'assenza di virus e frammento di gene o gene. Questo protocollo è stato utilizzato per inserire virus ricombinanti ingegnerizzati per gene nelle piantine di mais. Circa 12 giorni dopo l'iniezione, sono stati osservati fenotipi di silenziamento sulle foglie come necrosi e un fotosbiancamento.
La presenza di costrutto nelle foglie dopo l'infezione è stata rilevata osservando l'espressione della proteina fluorescente verde sotto una fluorescenza utilizzando un filtro GFP diverso. L'espressione della proteina fluorescente verde nelle foglie infette da virus del mosaico della coda di volpe è stata visualizzata come piccole aree puntate di fluorescenza distribuite sulle foglie e come grandi macchie nelle foglie infette dal virus del mosaico della canna da zucchero. Utilizzando l'analisi dell'espressione genica, è stata confermata l'infezione sistemica da virus del mosaico della coda di volpe ed è stato osservato il silenziamento genico o la soppressione della fitoene desaturasi e della lesione mimica 22.
Il costrutto utilizzava anche l'efficienza delle infezioni influenzate. Nel caso dell'infezione da virus del mosaico della coda di volpe, il vettore vuoto del virus del mosaico della coda di volpe e la lesione del virus del mosaico della coda di volpe mimica 22 in genere avevano le più alte efficienze di infezione rispettivamente al 53% e al 54%. Foxtail mosaic virus phytoene desaturase a un'efficienza leggermente inferiore al 39% e foxtail mosaic virus green fluorescent protein, alla più bassa efficienza al 16%Nel frattempo, l'efficienza di infezione della proteina fluorescente verde del virus del mosaico della canna da zucchero è stata dell'8% I tempi e i sintomi si baseranno sul vettore virale e sulla linea di mais utilizzati.
La mancanza di un fenotipo visivo potrebbe non significare una mancanza di silenziamento o espressione. Questo metodo può anche essere applicato alle tecnologie di editing genetico migliorando i metodi di consegna per gli RNA guida.
