Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Questo protocollo mostra due modi distinti di rilevare NKG2DL sulla superficie delle celle AML. La tecnica fornisce un metodo di colorazione veloce e intuitivo per rilevare tutti gli NKG2DL noti e possibilmente sconosciuti. Questo metodo consente la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML sfuse, il che consente di caratterizzare ulteriormente queste cellule.

Inizia scongelando la biotina e i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente. Far girare rapidamente la polvere NKG2D FC, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P-1000. Aggiungere 100 microlitri della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e mescolare accuratamente la soluzione con una micropipetta P-100.

Per scongelare le celle AML, rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarlo immediatamente in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente il mezzo e sciacquare il flaconcino utilizzando un millilitro di mezzo.

Centrifugare le cellule a 300 volte G per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le celle con cinque millilitri di mezzo RPMI contenente il 10%FCS e ripetere la centrifugazione. Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 per 10 alla settima cella per millilitro.

Quindi trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U 96 del pozzo e centrifugare la piastra a 300 volte G per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Preparare un mix master di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 microlitri per pozzo con una concentrazione finale di NKG2D di 10 microgrammi per millilitro per pozzo.

Aggiungere il master mix preparato e rimorsipare il pellet di cella con una pipetta da 200 microliter. Incubare e centrifugare la lastra come descritto nel manoscritto testuale. Preparare un master mix utilizzando streptavidina PE in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 microlitri.

Aggiungere il mix master alle celle e rimorsi il pellet con una pipetta multicanale da 300 microliter. Dopo aver centrifugato la piastra e scartato il supernatante, utilizzare una micropipetta multicanale da 300 microlitri per rimescolare i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone di colorazione più 7-AAD. Quindi analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.

I campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, con quattro diverse popolazioni in totale. La tipica strategia di gating inizia con la selezione della popolazione principale di cellule attraverso il loro FSC e SSC. Doppietti e cellule morte sono esclusi nell'analisi a valle.

I cancelli vengono regolati utilizzando i controlli FMO per garantire una corretta identificazione delle cellule positive. Le intensità di fluorescenza delle cellule positive per CD34 rispetto a NKG2DL sono evidenziate qui. Le cellule AML positive per CD34 mostrano una minore espressione superficiale di NKG2DL, che indica che l'espressione NKG2DL è associata alla mancanza di staminali.

Tre campioni di AML primari hanno dimostrato eventi positivi del 19,8, 49,8 e 89,4% per la colorazione delle proteine di fusione rispetto al 20,4, 50,4 e 90,6% per la colorazione degli anticorpi anti-NKG2DL in pool. D'altra parte, la colorazione del ligando singolo ha mostrato una serie di eventi positivi fino al 92% con percentuali variabili in base al ligando. Quando si tenta questo metodo, è molto importante essere veloci quando si scongelano le cellule AML primarie, perché sono fragili e possono morire facilmente durante questo passaggio.

Dopo aver eseguito questo protocollo, è possibile eseguire un ordinamento cellulare basato sul segnale NKG2DL per indagare ulteriormente le popolazioni.