Esistono diversi approcci di cristallizzazione per ottenere cristalli di grande e alta qualità sia per la cristallografia a raggi X che per la cristallografia neutronica. Uno di questi approcci è l'uso del metodo della dialisi. In questa tecnica, la soluzione proteica è separata da una soluzione precipitante da una membrana semi-permeabile.
Le molecole precipitanti si diffondono attraverso la membrana nella camera proteica. Quando si ottiene la corretta supersaturazione per una nucleazione spontanea, appariranno i primi nuclei. Qui dimostreremo un protocollo che può essere utilizzato da OptiCrys uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio che utilizza la cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata e i nostri pulsanti di micro dialisi per la coltivazione di cristalli di grande qualità per la cristallografia macromolecolare naturale basata sulla conoscenza del diagramma di fase di cristallizzazione.
Per un pulsante di micro dialisi con alcuni microlitri volume pipetta 35 microlitri di soluzione di glisozima nella camera di dialisi. Questo volume extra crea una forma leggermente a cupola sopra la camera di dialisi e impedisce la formazione di bolle d'aria. Prendere un applicatore e posizionare l'elastico o l'anello all'estremità di esso.
Posizionare la membrana sopra la camera e fissarla trasferendo l'elastico o l'anello dall'applicatore alla scanalatura del pulsante di dialisi. Trasferire il pulsante nel pozzo contenente la soluzione di cristallizzazione. Coprire il pozzo con un foglietto di copertura in vetro o un pezzo di nastro adesivo.
Mantenere il campione a 293 Kelvin in un incubatore di regolatori termici privo di vibrazioni. Sapendo che la cristallizzazione della dialisi offre vantaggi dal punto di vista della crescita cristallina, il banco di cristallizzazione cosiddetto OptiCrys è stato progettato e sviluppato nel nostro laboratorio per offrire un controllo combinato completamente automatizzato della temperatura e della composizione chimica dell'esperimento di cristallizzazione biomolecolare. L'ottimizzazione della crescita del cristallo da parte di OptiCrys si basa sui diagrammi della fase di concentrazione precipitante della temperatura.
La nucleazione avviene nella zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile e la crescita del cristallo avviene quindi nella zona metastabile dopo diagramma di fase, fino a quando la concentrazione proteica raggiunge la curva di solubilità che rappresenta l'equilibrio termodinamico tra soluzione e cristalli. Diminuendo la temperatura in caso di proteina con solubilità diretta o aumentando la concentrazione precipitante in caso di salatura, la soluzione di cristallizzazione rimane nella zona metastabile e non si verifica nucleazione. I cristalli crescono fino al raggiungimento del secondo equilibrio della soluzione cristallina e, successivamente, non si osserva un ulteriore aumento delle dimensioni dei cristalli.
Diminuendo la temperatura o aumentando la concentrazione del precipitante si ripete più volte fino a quando i cristalli raggiungono la dimensione desiderata. Aggiungere la soluzione proteica alla camera di dialisi dell'insieme a flusso a temperatura controllata, coprire la sovracamera con la membrana di dialisi e fissare la membrana con l'elastico o l'anello. Capovolgere la camera sopra e metterla sopra la camera di dialisi.
Premerlo delicatamente e lentamente per rimuovere tutta l'aria intrappolata tra due pezzi, fissare il serbatoio nella sua posizione avvitarlo delicatamente sopra la camera sopra. Aggiungere la soluzione di cristallizzazione alla camera del serbatoio e coprirla con il tappo ermetico. Trasferire questo assemblaggio e inserito nel supporto mammario del banco di cristallizzazione OptiCrys Crystal growth è un software di supervisione del Crystallization Bench OptiCrys.
Include quattro diverse interfacce grafiche o viste. La visualizzazione Home contiene pulsanti per passare alle altre visualizzazioni. Lo scopo dell'interfaccia di installazione è definire uno scenario di esperimento che può essere eseguito automaticamente nella visualizzazione test.
L'ultima vista è la vista di manutenzione. Per riavviare un esperimento, la vista di manutenzione deve essere aperta dove si trovano tutti i parametri essenziali per il buon funzionamento degli esperimenti di cristallizzazione. Aumentare la luminosità dalla sezione luminosa, la luce può aumentare da zero, nessuna luce a 100 luminosità massima.
Per controllare e monitorare la temperatura, viene utilizzata la sezione del regolatore di temperatura. Clicca sul pulsante per accenderlo. Impostare la temperatura nella sezione del set point e premere INVIO.
Sotto questo pulsante, ci sono due grafici. Quello rosso mostra il finale, la temperatura dell'ordine e il grafico giallo mostra la temperatura corrente. Mescolando una soluzione stock, un'iniezione della soluzione di cristallizzazione alla camera del serbatoio è controllata dalla sezione Palm.
Aggiungere la concentrazione della soluzione stock nella prima fase. Quindi trovare la concentrazione finale di ogni nuova soluzione di gruppo e aggiungerle alla sezione di concentrazione finale. Dopo aver premuto il pulsante calcola, scopri che verrà calcolato il volume della soluzione stock e aggiungerà il pannello del volume davanti a ciascun pannello di concentrazione.
Premere il pulsante di preparazione del lancio e attendere che la nuova soluzione premier sia pronta. Per lo scambio della soluzione di cristallizzazione, fare clic sul pulsante Voce soluzione. Per interrompere il processo, premere il pulsante Interrompi distribuzione.
Sul lato destro della sezione del microscopio, Ci sono diversi pannelli per la registrazione di informazioni importanti da ogni esperimento di crescita del cristallo. Aggiungere il nome delle proteine corrispondenti, il peso molecolare e la condizione di cristallizzazione in questa sezione. Definire un nome per gli esperimenti semplicemente digitandolo sul nome della cartella.
Dalla sezione immagini nb, selezionare il numero di immagini che devono essere scattate durante l'esperimento. Aggiungi il numero delle immagini e dal pannello a destra scegli la scala del timer. Fare clic sul pulsante della cartella per aprire la cartella.
In questa cartella è presente un file di testo contenente tutte le informazioni definite in precedenza per l'esperimento. Anche le immagini pronte per qualsiasi ulteriore trattamento vengono salvate in questa cartella. Anche lo zoom al microscopio può essere variato automaticamente.
Modifica lo zoom usando il pulsante più e meno sopra la sezione del microscopio per aumentare o diminuire rispettivamente l'ingrandimento. Esistono tre modi diversi per misurare la dimensione del cristallo. Per misurare la lunghezza o la larghezza utilizzare il vettore di larghezza.
A seconda della forma cristallina, è possibile scegliere gli strumenti specifici della parte sinistra della sezione del microscopio. Ad esempio un poligono rettangolare o poligono. I valori verranno visualizzati nella sezione della misura.
Nella prima serie di esperimenti, i pulsanti di microdialisi sono stati immersi nelle soluzioni di cristallizzazione con diverse concentrazioni di sale. In questo semplice esperimento della griglia di cristallizzazione, l'unica variabile è la concentrazione precipitante. mentre la temperatura è mantenuta costante.
Lievi variazioni nella concentrazione di sale permettono di studiare il diagramma della fase di cristallizzazione aumentando la concentrazione di sale da 0,7 a 1,2 aumenti di supersaturazione molare e la soluzione nella zona di nucleazione si sta allontanando dalla zona metastabile. Di conseguenza, si osserva una variazione di dimensioni e numero di cristalli con il numero di cristalli che aumenta e le loro dimensioni diminuiscono. Nel primo esperimento con OptiCrys nella condizione sperimentale data, una volta raggiunto l'equilibrio nella camera di dialisi, la soluzione di cristallizzazione si trova nella zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile del diagramma di fase di cristallizzazione.
Di conseguenza, solo pochi nuclei vengono generati durante la prima fase dell'esperimento. Al fine di mantenere la crescita dei cristalli nella zona metastabile e controllare il processo di crescita del cristallo, la temperatura è stata cambiata a diversi intervalli di tempo. Ogni volta che l'equilibrio della soluzione cristallina è stato completato, la temperatura è stata variata.
Pertanto la temperatura è scesa a 291 Kelvin, 288 Kelvin e infine 275 Kelvin per mantenere la crescita del cristallo selezionato nella zona metastabile. Il risultato di questo esperimento è un singolo cristallo grande, con il volume richiesto per la cristallografia macromolecolare naturale. I due esperimenti successivi dimostrano la reversibilità degli esperimenti di dialisi a temperatura controllata per la nucleazione, la crescita cristallina, la dissoluzione e la ricrescita.
Nel secondo esperimento con OptiCrys la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione è stata mantenuta costante attraverso l'esperimento e la temperatura variava. La temperatura iniziale fu fissata a 291 Kelvin. A causa dell'elevata supersaturazione, un gran numero di piccoli cristalli apparve nella camera di cristallizzazione.
In accordo con il concetto di solubilità diretta delle proteine, aumentando gradualmente la temperatura a 313 Kelvin tutti i cristalli dovevano essere sciolti. Infine, abbassando la temperatura a 295 Kelvin, la seconda nucleazione iniziò in prossimità della zona metastabile e permise di controllare il processo di nucleazione con conseguente formazione di un numero inferiore di nuclei. Un'ulteriore crescita dei cristalli permise di generare la popolazione uniforme di cristalli più grandi.
In questo esperimento, cambiare la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione a temperatura costante porta ad ottenere una popolazione uniforme di cristalli più grandi. La condizione di cristallizzazione era simile all'esperimento precedente. Lo scioglimento dei cristalli è stato ottenuto abbassando gradualmente la concentrazione di NaCl da 0,9 molare a zero.
La riduzione della concentrazione di sale mantiene la soluzione nella zona sottosatura del diagramma di fase che porta alla dissoluzione dei cristalli. Quindi la nuova soluzione di cristallizzazione con una forza ionica inferiore rispetto al passato è stata iniettata nella camera del serbatoio. A questa concentrazione precipitante appare il minor numero di cristalli e i cristalli raggiungono un volume maggiore di prima.
Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del campione e regola il software di controllo per la coltivazione di cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità per la cristallografia macromolecolare naturale utilizzando uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio. Questa procedura passo-passo è stata progettata e beneficia della conoscenza del diagramma della fase di cristallizzazione al fine di separare la nucleazione e la crescita dei cristalli. Inoltre, un protocollo per la coltivazione di cristalli con modelli di microcitosi viene presentato anche utilizzando i pulsanti di macrocitosi come alternativa quando OptiCrys non è disponibile.
Oltre alle strategie che ho menzionato per OptiCrys cambiare la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione e della temperatura e scattare immagini dovrebbe essere fatto manualmente. È necessario utilizzare la vibrazione regolata termicamente per l'incubatore per mantenere costante la temperatura, che è un passaggio critico nella metodologia dimostrata.
