La replicazione virale dell'HBV nell'extraepatico gioca un ruolo importante nella patogenesi delle sindromi extraepatiche. Attualmente, i modelli di coltura cellulare per l'avvio dell'infezione da HBV extraepatica sono limitati. Presentiamo un modello di infezione non epatica in vitro per aiutare a identificare nuovi fattori ospiti che influenzano la replicazione dell'HBV e indagare le malattie renali correlate all'HBV.
Rispetto ai tradizionali modelli di infezione da HBV, abbiamo adottato e progettato la linea cellulare 293T, 293T-NE-3NR e l'abbiamo co-coltivata con HepG2.2.15. L'infezione da HBV deve essere eseguita in un laboratorio di livello due o biosicurezza di livello tre. Le pratiche di sicurezza di laboratorio dovrebbero essere seguite per garantire la sicurezza del personale di laboratorio e tutti i ricercatori dovrebbero essere vaccinati e rilevare gli anticorpi HBS positivi prima di eseguire esperimenti HBV.
Inizia coltivando le cellule HepG2.2.15 tenendo presente che il supernatante cellulare e tutte le punte, le fiasche, le piastre e i tubi che entrano in contatto con HepG2.2.15 dovrebbero essere immersi nel 2% di virucidio durante la notte prima dello smaltimento. Rimuovere il flaconcino contenente cellule HepG2.2.15 dall'azoto liquido e scongelarlo in un delicato vortice in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Trasferire le cellule in un pallone da coltura del tessuto quadrato di 25 centimetri e aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura completo.
Coltura le cellule HepG2.2.15 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Cambia il mezzo ogni tre giorni. Quando è pronto, raccogliere il supernatante cellulare in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.
Chiudere saldamente il coperchio e avvolgerlo con pellicola di paraffina. Per rimuovere i frammenti cellulari, filtrare il supernatante HepG2.2.15 con una membrana di 0,45 micrometri in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri. Quindi aggiungere 14 millilitri di supernatante filtrato a una colonna concentratore di virus e chiudere il coperchio.
Centrifugare la colonna a 3.200 volte g per 35 minuti in una centrifuga rotante orizzontale e raccogliere il concentrato supernatante HepG2.2.15 in un tubo da 1,5 millilitri. Eseguire PCR in tempo reale per assicurarsi che la concentrazione se il DNA HBV nel concentrato supernatante HepG2.2.15 si trova all'interno dell'intervallo di curve standard. Diluire il concentrato di 20 volte aggiungendo 10 microlitri a 190 microlitri di DMEM in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Insieme al concentrato supernatante, preparare un controllo negativo, un controllo positivo e quattro diluizioni del riferimento quantitativo. Aggiungere 450 microlitri di tampone di estrazione del DNA HBV a ciascun campione e centrifugarli a 12.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Unire 27 microlitri di mix master PCR e tre microlitri di enzima Taq polimerasi per campione in tubi PCR posti sul ghiaccio.
Quindi aggiungere 20 microlitri del campione centrifugato a ciascun tubo. Eseguire la PCR in tempo reale in base alle indicazioni manoscritte ed esportare i valori CT per ottenere una curva standard. Dividere il concentrato supernatante HepG2.2.15 in aliquote e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Preparare il mezzo di infezione secondo le indicazioni manoscritte. Quindi seminare HepG2-NE in due pozzi, 293T-NE-3NR cellule in due pozzi e 293T-NE in un pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato per 24 ore.
Dopo l'incubazione, osservare le cellule e procedere con l'infezione se sono sane. Aggiungere 500 microlitri del complesso di infezione ad ogni pozzo e incubare le cellule per altre 24 ore. Lavare le cellule due volte con 500 microlitri di PBS.
Quindi aggiungere un millilitro di mezzo ad ogni pozzo. Cambiare delicatamente il mezzo ogni due giorni. Il giorno 11, lavare delicatamente le cellule due volte con 500 microlitri di PBS e fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza.
Semina 100.000 cellule per pozzo di HepG-NE in due pozzi, 293T-NE-3NR in due pozzi e 293T-NE in un unico pozzo della piastra. Semina 100.000 cellule per pozzo di HepG2.2.15 in cinque inserti a membrana in una piastra separata a sei potti. Incubare le cellule per 24 ore.
Dopo l'incubazione, assicurarsi che le cellule siano tutte aderenti e in buono stato. Scartare il mezzo nella piastra a sei pozzi e gli inserti della membrana cellulare. Quindi posizionare gli inserti della membrana con HepG2.2.15 nella piastra a sei pozzi seminata con HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato, cambiando il mezzo ogni tre o quattro giorni. Dopo 10 giorni, rimuovere gli inserti della membrana, lavare delicatamente le cellule con PBS due volte e fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza. L'incubazione con l'anticorpo primario HBcAg e il DAPI ha portato a una colorazione distinta se osservata con un obiettivo 10X su un microscopio invertito fluorescente.
La localizzazione nucleare è stata confermata dalla colorazione con l'espressione DAPI e NTCP-EGFP è stata identificata con la fluorescenza verde. I siti di espressione di HBcAg erano situati con fluorescenza rossa. Quando DAPI, NTCP e HBcAg si trovano nella stessa cella, la cella è stata infettata correttamente da HBV.
Il gruppo Cyclosporin A era il controllo negativo perché impedisce all'HBV di entrare nelle celle bloccando NTCP. HBcAg è stato rilevato in 293T-NE-3NR, ma non in cellule 293T-NE che indicano NTCP non è l'unico fattore essenziale per l'infezione da HBV in 293T. Un buon stato cellulare e un funzionamento efficiente sono i punti chiave per ottenere risultati di infezione di successo.
Anche il lavaggio delicato e il cambiamento del supporto dopo l'infezione sono importanti. In alternativa, il metodo di infezione da HBV con cellule HepG2-NE a base di epatoma ha una maggiore efficienza di infezione rispetto a questo metodo ed è adatto per lo screening anti-HBV dei farmaci. Modellare l'infezione da HBV in 293T-NE-3NR è un utile complimento per il modello cellulare tradizionale a causa dello sfondo non epatico di queste cellule.
Questo metodo faciliterà lo studio dell'infezione da HBV nelle cellule non epatiche e dei fattori ospiti necessari per il fegato dell'HBV.
