Questo lavoro è stato supportato in parte da fondi di avvio UCSD diretti a O.S.A.

1. Allevamento della colonia di C. quinquefasciatus
<ol><li>Allestire più colonie di adulti di C. quinquefasciatus in gabbie di dormitori di insetti. NOTA: Le colonie sono state fornite dalla dott.ssa Laura Harrington alla Cornell University20. Protocolli dettagliati per l'allevamento delle zanzare Culex possono essere trovati in altra letteratura21.<ol>
<li>Mantenere le zanzare a 25 ± 1 °C al 30% di umidità con un ciclo giorno:notte di 12:12 h.</li>
		<li>Fornire una soluzione di zucchero al 20% ad libitum introducendo un contenitore per la soluzione di zucchero con uno stoppino nella gabbia o saturando i batuffoli di cotone con la soluzione di zucchero e posizionandola all'interno della gabbia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare che le zanzare si accoppiano per almeno 3 giorni prima dell'alimentazione del sangue (Figura 2A).</li>
</ol>2. Raccolta di embrioni in stadio pre-blastoderma di C. quinquefasciatus
<ol><li>Dopo 3-6 giorni dopo l'eclosion, fornire alle femmine 1-2 ml di farina di sangue bovino citrato attraverso una membrana sintetica e riscaldata a circa 40 °C in un sistema di alimentazione del sangue (Figura 2B). Esistono anche protocolli alternativi di alimentazione del sangue che possono essere utilizzati per le zanzare Culex (ad esempio, vedi ref21). NOTA: C. quinquefasciatus è noto per una preferenza per il sangue aviario. Alcuni laboratori utilizzano uccelli vivi anestetizzati o sangue aviario per la loro fonte di farina di sangue21,22,23. Tuttavia, le colonie possono essere addestrate / selezionate per nutrirsi di sangue bovino o di piccoli roditori se questa caratteristica è selezionata per più generazioni.<ol>
<li>Lasciare riposare le femmine per un minimo di 3 giorni dopo l'alimentazione del sangue per sottoporsi all'oogenesi e alla maturazione delle uova prima di indurre l'ovodeposizione per esperimenti di microiniezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno delle microiniezioni embrionali, creare una tazza di ovodeposizione con acqua di ovodeposizione infusa organicamente. L'acqua di deposizione deve essere prodotta fermentando le feci di coniglio (50 g / L), l'erba in decomposizione (4,5 g / L) o il cibo per pesci (25 g / L) in acqua nel corso di 5 o più giorni24,25.</li>
	<li>Posizionare la tazza di ovodeposizione nella gabbia e posizionare l'intera gabbia in una posizione buia (Figura 2C).</li>
	<li>Dopo ogni 30 minuti, controlla la tazza per le zattere di uova.<ol>
<li>Se sono presenti zattere di uova, raccogliere le zattere raccogliendole con un pennello e posizionarle su una carta da filtro bagnata (Figura 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Allineamento degli embrioni dello stadio pre-blastoderma di C. quinquefasciatus
<ol><li>Separare le uova dalle zattere premendo sulla zattera e prendendo in giro le uova singolarmente usando un pennello a punta fine e una pinna (Figura 2E).</li>
	<li>Allineare le singole uova su una sottile striscia di nastro adesivo biadesivo posto sulla parte superiore di un vetrino (Figura 2F).</li>
	<li>Durante l'allineamento, prova a puntare il lato anteriore di ogni uovo nella stessa direzione per una più facile accessibilità. NOTA: Un metodo alternativo di allineamento delle uova senza nastro adesivo biadesivo può essere trovato in un protocollo di microiniezione embrionale Nasonia vitripennis precedentemente pubblicato26.</li>
	<li>Coprire le uova con la miscela di olio di alocarburi. NOTA: La miscela di halocarbon può essere preparata in anticipo mescolando delicatamente due reagenti alocarburi e acqua (9:1:20, halocarbon 700: halocarbon 27: acqua ultrapura) e quindi incubando la miscela durante la notte a 25οC per facilitare la saturazione dell'acqua dell'olio di alocarburi.</li>
</ol>4. Preparazione dell'ago per microiniezioni
<ol><li>Generare gli aghi di vetro capillare alluminosilicato utilizzando un estrattore di micropipette di vetro.<ol>
<li>Posizionare un vetro capillare in alluminosilicato in un estrattore di aghi, come da istruzioni del manuale utente dell'estrattore dell'ago. NOTA: Possono essere utilizzati anche aghi capillari al quarzo e borosilicato, ma per questo esperimento è preferibile l'alluminosilicato a causa della sua relativa convenienza e durata.</li>
		<li>Impostare Calore su 516, Velocità su 100, Ritardo su 70, Tiro su 97 e Pressione su 500 sull'estrattore dell'ago.</li>
		<li>Attivare l'estrattore dell'ago, secondo le istruzioni dell'estrattore e ripetere se necessario per aghi aggiuntivi. NOTA: Durante il processo di iniezione, gli aghi spesso si intasano o si rompono accidentalmente, pertanto si consiglia vivamente di tirare aghi aggiuntivi per un singolo esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Smussare la punta dell'ago toccando delicatamente la punta dell'ago tirato sulla piastra abrasiva diamantata rotante per circa 10 s con un angolo di 50 °. NOTA: la smussatura dell'ago lo apre per consentire al fluido di fluire attraverso di esso, creando anche una punta più affilata per una più facile penetrazione nell'embrione. Un esempio di ago corretto può essere visto in un precedente articolo26.</li>
	<li>Conservare gli aghi tirati e smussati incorporandoli in linee di argilla modellatrice in una capsula di Petri. NOTA: per garantire la migliore qualità per le punte degli aghi, gli aghi devono essere appena tirati e smussati il più vicino possibile al momento dell'iniezione.</li>
</ol>5. Caricamento della miscela di iniezione
<ol><li>Preparare la miscela di iniezione costituita da reagenti per la modifica del genoma (ad esempio, 200 ng/μL sgRNA e 200 ng/μL cas9 miscela), o soluzioni di iniezione preferite e tenerla sul ghiaccio. NOTA: Questo mix può essere preparato in attesa che le uova vengano deposte. Maggiori dettagli sulla produzione di Cas9 e sgRNA e sulla preparazione per la microiniezione possono essere trovati nelle precedenti pubblicazioni27,28,29,30.</li>
	<li>Caricare 2 μL di miscela per iniezione nell'ago per iniezione utilizzando una punta del microloader.</li>
</ol>6. Configurazione della microiniezione
<ol><li>Posizionare l'ago per iniezione riempito in un micromanipolatore collegato a un microiniettore elettronico.</li>
	<li>Posizionare il vetrino contenente le uova allineate sul palco di un microscopio composto.</li>
	<li>Utilizzando il micromanipolatore e il microscopio composto, allineare l'ago per mirare all'estremità posteriore dell'embrione con un angolo di 25-35 °.</li>
</ol>7. Microiniezione di embrioni (Figura 2G)
<ol><li>Inserire con attenzione l'ago nell'embrione e iniettare la miscela in una quantità di circa il 10% del volume dell'embrione (700-800 pL a seconda delle dimensioni delle uova). NOTA: Durante l'iniezione, l'uovo deve gonfiarsi leggermente, tuttavia, se viene iniettato troppo liquido, le uova possono scoppiare o il liquido citoplasmatico può fuoriuscire.</li>
	<li>Iniettare circa 20 uova alla volta, quindi fermarsi ed eseguire procedure di recupero dell'embrione. NOTA: Durante l'iniezione, c'è un'alta probabilità che gli aghi si intasino o si rompano. Se si verifica uno zoccolo, che può essere determinato da una mancanza di fluido per iniezione che scorre attraverso l'ago, provare a pulire l'ago con la funzione di pulizia sul microiniettore elettronico o provare a ri-smussare l'ago. Se nessuno dei due passaggi funziona, passare rapidamente a un nuovo ago assicurandosi che le uova preparate rimangano inumidite.</li>
</ol>8. Recupero e schiusa degli embrioni
<ol><li>Lasciare le uova indisturbate per almeno 5 minuti. Entro 20 minuti dopo l'iniezione, rimuovere con cura l'olio alocarbonio spazzolando leggermente con un pennello pulito (Figura 2H).</li>
	<li>Sollevare delicatamente le uova con un pennello e metterle in una tazza di acqua a doppio distillato (Figura 2I). Fare attenzione a mantenere le uova sulla superficie dell'acqua.</li>
	<li>Controllare le uova ogni giorno per 7 giorni per la schiusa (Figura 2J).</li>
	<li>Seguire le normali procedure di allevamento larvale21.</li>
</ol>9. Screening per la modifica del genoma
<ol><li>Schermare le zanzare iniettate per i fenotipi mutanti usando uno stereoscopio (Figura 2K).<ol>
<li>Verificare le mutazioni che non hanno un fenotipo facilmente riconoscibile, mediante amplificazione PCR, test dell'endonucleasi I T7 e sequenziamento mediante subclonazione della regione bersaglio31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare ulteriori incroci tra individui iniettati per rilevare mutazioni ereditarie all'interno della linea germinale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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Con i recenti sforzi per generare strumenti geneticamente modificati per il controllo dei vettori di zanzare, è necessario sviluppare e ottimizzare i protocolli di microiniezione degli embrioni per i comuni vettori di malattie delle zanzare. Sebbene siano stati sviluppati metodi per le zanzare Aedes e Anopheles, un protocollo progettato specificamente per Culex è stato minimamente esplorato. In generale, i protocolli di iniezione di embrioni di zanzara possono essere suddivisi in 3 fasi generali: 1) raccolta e preparazione degli embrioni, 2) iniezione di embrioni e 3) recupero post-iniezione. Per generare con successo mutanti, tutti e tre i passaggi devono essere ottimizzati per le specie bersaglio. Questo protocollo modificato per la microiniezione di embrioni è specifico per il successo dell'ingegneria del genoma delle zanzare Culex.
Massimizzare la raccolta degli embrioni è un collo di bottiglia comune nei protocolli di microiniezione degli embrioni. Al fine di aumentare il numero di uova raccolte in un breve periodo di tempo, le zanzare sono state limitate da un substrato di ovodeposizione per 2-3 giorni dopo la farina di sangue. È importante notare che C. quinquefasciatus tende a preferire le fonti di sangue aviario rispetto alle fonti di mammiferi o all'alimentazione di membrana con sangue di mammifero. Tuttavia, molti ricercatori hanno difficoltà ad acquisire una fonte affidabile di avi vivi o sangue aviario per l'alimentazione del sangue, quindi le scorte di laboratorio possono essere adattate per nutrirsi di fonti di sangue più accessibili. È anche fondamentale utilizzare acqua ricca di nutrienti per il substrato di ovodeposizione in quanto fornisce segnali di ovodeposizione per C. quinquefasciatus e la maggior parte degli altri vettori Culex. Esistono molti metodi per generare acqua ricca di sostanze nutritive, che potrebbe essere necessario ottimizzare tra i laboratori per garantire che un numero appropriato di uova sia disponibile per la microiniezione. Ad esempio, mentre questo metodo ha avuto il maggior successo con le feci di coniglio fermentate in acqua deionizzata per 5 o più giorni, altri ricercatori hanno più successo con erba o cibo per pesci come fonte di nutrienti e alcuni anche con acqua distillata21.
Poiché le zanzare Culex depongono gruppi di uova in zattere, la raccolta delle uova è abbastanza semplice. Le uova possono essere semplicemente raccolte raccogliendo l'intera zattera con un pennello. La separazione degli ovuli è più complicata, ma essenziale per un'iniezione di successo. Le uova possono essere accuratamente separate dalla zattera applicando una leggera pressione verso il basso tra le uova con pennello o pinna. Con un po 'di pratica, più utenti sono stati in grado di separare in modo affidabile le uova singole dalle zattere di uova. Dopo aver separato ogni uovo, le uova vengono allineate nello stesso orientamento su nastro adesivo a doppia faccia, che stabilizza le uova durante la microiniezione. Le uova vengono iniettate nell'estremità posteriore affusolata e l'aggiunta di olio alocarbonico mantiene le uova umide durante la manipolazione.
Per limitare il danno embrionale durante la microiniezione, gli aghi per iniezione devono essere di forza appropriata e smussati ad un angolo appropriato. Gli aghi in alluminosilicato smussati per 10 secondi con un angolo di 50° hanno avuto i migliori risultati, ma anche gli aghi in borosilicato e quarzo possono funzionare, anche se possono essere meno durevoli e più costosi. Inoltre, una corretta smussatura dell'ago facilita un migliore flusso delle miscele Cas9 e sgRNA e crea un punto più nitido per una più facile penetrazione nell'embrione. In molti casi, la smussatura è anche un modo efficace per riparare rapidamente gli aghi intasati invece di spendere tempo e sforzi per sostituire gli aghi intasati.
Dopo l'iniezione, le uova devono rimanere indisturbate per almeno 5 minuti con l'olio di alocarbonio rimosso immediatamente dopo spazzolandolo delicatamente con un pennello pulito. Dopo la rimozione dell'olio di alocarburi, le uova iniettate possono essere poste in acqua per schiudersi, che in genere si verifica entro 3 giorni dall'iniezione. Con la pratica e un numero sufficiente di uova, questo protocollo può ottenere mutazioni somatiche e germinali coerenti in C. quinquefasciatus ed è abbastanza versatile da essere facilmente adattabile ad altre zanzare Culex.

C. quinquefasciatus, comunemente nota come zanzara della casa meridionale, è un vettore competente di numerosi agenti patogeni tra cui il virus del Nilo occidentale (WNV), l'encefalite giapponese, l'encefalite di Saint Louis e l'encefalite equina orientale. In particolare, da quando è stato rilevato per la prima volta a New York nel 1999, il WNV è diventato una delle principali malattie trasmesse da vettori in tutti gli Stati Uniti continentali (USA) con oltre 50.000 casi umani segnalati con circa 2.300 morti tra il 1999 e il2018 1 e oltre 4.500 casi equini segnalati tra il 2008-20192. Inoltre, almeno 23 specie di uccelli trovate in Nord America sono state colpite da infezioni da WNV con almeno 12 specie classificate come irrecuperabili a seguito di WNV3. L'impatto del WNV sulle popolazioni umane, equine e aviarie è dovuto al comportamento opportunistico di alimentazione dei suoi vettori. In genere, gli uccelli sono gli ospiti principali per WNV e gli esseri umani e i cavalli sono ospiti incidentali o senza uscita. Alcuni agenti patogeni vettorizzati da C. quinquefasciatus infettano solo uccelli come il parassita della malaria aviaria, Plasmodium relictum. Nelle Hawaii, C. quinquefasciatus è un vettore principale della malaria aviaria e ha causato l'estinzione di molte specie di uccelli nativi4,5.
Per controllare le malattie trasmesse da C. quinquefasciatus, ricercatori e agenzie di controllo dei vettori hanno usato strumenti di controllo della popolazione di zanzare comunemente stabiliti come l'applicazione di insetticidi6, tuttavia, questi metodi sono costosi, non specie-specifici, e hanno un'efficacia limitata in quanto la resistenza agli insetticidi è elevata in molte popolazioni di C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Altre tecniche di controllo, come le strategie di controllo della popolazione basate su Wolbachiasono state sviluppate negli ultimi anni10,11, ma i costi di fitness associati all'infezione da Wolbachia limitano la fattibilità di questo approccio per questo vettore12. Esistono anche metodi di controllo basati sulla genetica che sono stati sviluppati in altre specie di zanzare come Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 e Anopheles stephensi16, incluso lo sviluppo di zanzare resistenti ai patogeni17,18,19, che potrebbero anche essere sviluppati per C. quinquefasciatus se gli strumenti di ingegneria del genoma richiesti sono sviluppato per questa specie. Tuttavia, la biologia di C. quinquefasciatus differisce notevolmente da altri vettori di zanzare Aedes e Anopheles, il che ha reso difficile lo sviluppo di tecnologie genetiche simili in questo vettore. Con l'avvento delle tecnologie di ingegneria del genoma basate su CRISPR, l'ingegneria del genoma preciso è diventata sempre più banale, economica e adattabile e di conseguenza ha portato allo sviluppo di nuovi strumenti genetici in un'ampia varietà di specie.
Per generare mutazioni con tecnologie basate su CRISPR, una miscela di proteina Cas9 e RNA guida sintetico (sgRNA), complementare ai loci desiderati, viene microiniettata in embrioni in stadio pre-blastoderma. Poiché le femmine di C. quinquefasciatus depongono le uova in gruppi attaccati in una struttura a zattera galleggiante (Figura 1), al contrario di ovopositare singole uova, un tratto delle zanzare Aedes e Anopheles, le microiniezioni embrionali sono sempre più complicate in questa specie. Le larve di Culex emergono anche dal lato anteriore di ciascun uovo, che è in contatto con la superficie dell'acqua (Figura 1), quindi l'orientamento dell'uovo dopo la manipolazione è importante in questa specie. Qui descriviamo un protocollo dettagliato progettato per la microiniezione della proteina Cas9 e sgRNA negli embrioni di C. quinquefasciatus. Questo protocollo è stato progettato per accogliere tratti unici della biologia Culex al fine di migliorare la sopravvivenza degli embrioni e i tassi di mutazione del genoma attraverso alcuni passaggi che sono fondamentali per la raccolta tempestiva degli ovuli e la sopravvivenza degli ovociti.

<table><tbody><tr><td>9 oz clear plastic pet cup</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>Insect Rearing and Egg Collection</td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Cas9 Protein with NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Olympus BX41</td><td></td><td>Microinjection, for embryo injection</td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>Microinjection, to be used with beveler</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Microinjection, embryo collection</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>Line Maintenance</td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinjection, needle beveling</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td>Microinjection, needle pulling</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Non-Drying Modeling Clay</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinjection, needle storage</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Microinjection, for embryo alignment</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% sugar solution for adult sugar source.</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr></tbody></table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus è un vettore di una vasta gamma di malattie trasmesse da vettori come la malaria aviaria, il virus del Nilo occidentale (WNV), l'encefalite giapponese, l'encefalite equina orientale, la filariosi linfatica e l'encefalite di Saint Louis. In particolare, la malaria aviaria ha svolto un ruolo importante nell'estinzione di numerose specie endemiche di uccelli insulari, mentre il WNV è diventato un'importante malattia trasmessa da vettori negli Stati Uniti. Per ottenere ulteriori informazioni sulla biologia di C. quinquefasciatus ed espandere la loro cassetta degli attrezzi per il controllo genetico, dobbiamo sviluppare metodi più efficienti e convenienti per l'ingegneria del genoma in questa specie. Tuttavia, alcuni tratti biologici unici delle zanzare Culex, in particolare le loro zattere di uova, hanno reso difficile eseguire le procedure di microiniezione necessarie per l'ingegneria del genoma. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un protocollo di microiniezione embrionale ottimizzato che si concentra sulla mitigazione degli ostacoli tecnici associati alle caratteristiche uniche delle zanzare Culex. Queste procedure dimostrano metodi ottimizzati per la raccolta delle uova, la separazione della zattera d'uovo e altre procedure di manipolazione essenziali per il successo della microiniezione in C. quinquefasciatus. Se abbinate alla tecnologia di editing del genoma CRISPR / Cas9, queste procedure ci consentono di ottenere mutazioni germinali site-specific, efficienti ed ereditabili, che sono necessarie per eseguire l'ingegneria avanzata del genoma e sviluppare tecnologie di controllo genetico in questo importante, ma attualmente poco studiato, vettore di malattia.

In esperimenti precedentemente pubblicati questo metodo è stato utilizzato per generare con successo mutazioni somatiche e germinali di un gene critico per lo sviluppo della pigmentazione dell'occhio scuro, bianco (CPIJ005542)30 (Tabella 1). Le mutazioni somatiche generate da CRISPR/Cas9 sono state valutate mediante screening per la perdita di pigmentazione negli occhi dello stadio pupale di individui iniettati (G0). Le mutazioni somatiche erano generalmente presenti come fenotipi a mosaico in cui alcune ma non tutte le cellule hanno il fenotipo mutante. Ad esempio, le mutazioni somatiche del gene bianco hanno portato a una miscela di ommatidia con fenotipi che mancano di pigmentazione e quelli con un fenotipo pigmentato wildtype30. Quando c'è stata una mutazione germinale del gene bianco, tuttavia, la generazione successiva (G1) ha ereditato il fenotipo completo degli occhi bianchi. I tassi di mutazione germinale sono stati determinati incrociando individui G0 a mosaico e segnando per la prole dagli occhi completamente bianchi (G1). Questi esperimenti hanno portato a un tasso di sopravvivenza embrionale dal 64% all'82%, nonché a un tasso di mutagenesi somatica dal 37% al 57% e a un tasso di mutagenesi germinale del >61% (Tabella 1). Con il multiplexing di sgRNA per colpire più loci nello stesso gene, i tassi di mutagenesi somatica e germinale sono aumentati fino all'86% (Tabella 1). Inoltre, per molte generazioni, le scorte omozigoti vitali dei mutanti bianchi sono state conservate con successo in laboratorio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figura 1: Zattera d'uovo di C. quinquefasciatus e morfologia dell'uovo singolo. Viste dorsali (A), laterali (B) e ventrali (C) delle zattere di uova C quinquefasciatus. Le femmine di C. quinquefasciatus depongono le uova con il lato anteriore più bulboso che tocca la superficie dell'acqua mentre il lato posteriore più appuntito lontano dalla superficie dell'acqua (D). A- anteriore; P- posteriore <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figura 2: Linea temporale per la creazione di mutanti di C. quinquefasciatus mediante microiniezione. Cronologia della preparazione della colonia di C. quinquefasciatus e della raccolta di embrioni per la microiniezione (A-D). Le uova raccolte vengono quindi separate (E) allineate nello stesso orientamento e ricoperte di olio di alocarbonio (F). Le uova vengono quindi iniettate (G) e lasciate riposare per un minimo di 5 minuti prima di rimuovere l'olio alocarbonio (H). Le uova vengono quindi trasferite in una fonte di acqua pulita (I) per la schiusa (J) e sottoposte a screening per fenotipi mutanti (K). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Sopravvivenza</td>
			<td colspan="3">Mosaicismo somatico (G0)</td>
			<td>Mutagenesi germinale (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA ·</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Totale (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Totale (%)</td>
			<td>G1 mutanti (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Tassi di sopravvivenza e mutazione degli embrioni iniettati con gRNA singoli e multiplexati mirati al bianco. La tabella viene ristampata con il permesso di30

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.4K Views.  University of California, San Diego. Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Video: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Ricerca

Genetica

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biologia dello sviluppo

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

phiC31 Transgenesi embrionale mediata dall'integrasi in Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

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