Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dalle sovvenzioni F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) del National Institute on Deafness and other Communication Disorders del National Institutes of Health.

Questo studio è stato condotto in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee della New York University School of Medicine.
1. Sezionare la laringe di ratto
<ol><li>Eutanasia ratto secondo il protocollo istituzionalmente approvato. Rasare il collo ventrale dalla mandibola al manubrio e tamponare con alcool per prevenire la contaminazione della pelliccia nei campioni di tessuto.</li>
	<li>Sotto un cannocchiale di dissezione con ingrandimento 10x asportare l'intera laringe creando un'incisione del collo della linea mediana con un bisturi fino a quando la trachea non è esposta.</li>
	<li>Separare i muscoli laringei estrinseci ventrali sulla linea mediana per esporre la laringe usando una pinza e sezionando le forbici o un bisturi.</li>
	<li>Tagliare la trachea caudale al terzo anello tracheale e fare un'incisione rostrale all'osso ioide per asportare l'intera laringe usando le forbici sezionanti.</li>
	<li>Rimuovere i tessuti laringei estrinseci (esofago, ghiandola tiroidea e muscoli laringei estrinseci) dalla laringe utilizzando strumenti di microdissezione (pinzette, spilli e microscissori) sotto ingrandimento.</li>
	<li>Con i microscissori, tagliare in due la laringe dorsalmente tra gli aritenoidi usando la linea mediana tra i muscoli cricoarytenoidi posteriori come punto di riferimento. Appuntare le pareti laterali della laringe per esporre le corde vocali e quindi tagliare in due ventralmente attraverso la linea mediana della cartilagine tiroidea tra la commissura anteriore delle corde vocali con microscissori (Figura 1). NOTA: questo passaggio può essere facoltativo; può essere saltato per mantenere la laringe intera. La bisezione delle laringi consente più tecniche di immunocolorazione utilizzando separatamente i lati destro e sinistro della stessa laringe.</li>
	<li>Risciacquare ogni emi-laringe in soluzione tamponata con fosfato (PBS) per ~ 10 s e asciugare delicatamente con un tergicristallo per ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento.</li>
</ol>2. Fissare e/o congelare il tessuto laringeo
NOTA: la fissazione potrebbe non essere ideale per tutti i protocolli di immunocolorazione. Spesso i tessuti laringei sono congelati con il flash fresco immediatamente dopo la dissezione. Saltare il passaggio 2.1 per congelare il tessuto laringeo senza fissazione.
<ol><li>Per fissare le emi-laringi posizionare i tessuti in un tubo di centrifuga riempito con formaldeide al 4% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 70 giri / min. Trasferire i tessuti in un tubo centrifugo pulito e risciacquare 3 volte per 20 minuti in PBS. Quindi trasferire in un tubo di centrifuga pulito e immergere in una soluzione di saccarosio al 20% / glicerolo al 5% (~ 18 ore o fino a quando il tessuto non affonda) a 4 ° C. ATTENZIONE: La formaldeide è pericolosa e deve essere utilizzata in una cappa aspirante insieme a dispositivi di protezione individuale appropriati.</li>
	<li>Posizionare tutte le emi-laringi in una posizione uniforme in un criostampo riempito con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Per un'emilaringe, posizionare il tessuto con la superficie mediale della corda vocale rivolta verso il fondo della criostampe e l'aspetto longitudinale della piega vocale parallelo al bordo inferiore dell'apertura del criostampo. Per le laringi intere, posizionare il tessuto con i cricoarytenoidi posteriori rivolti verso il fondo del criostampo e l'aspetto longitudinale della piega vocale parallelo al bordo inferiore dell'apertura del criostampo. NOTA: l'orientamento laringeo coerente all'interno del composto OCT è fondamentale per la criosezione della piega vocale del ratto. Una volta che l'emilaringe è incorporata e congelata, deve essere scongelata per cambiare il suo orientamento, introducendo così rischi di danni ai tessuti da più cicli di disgelo-congelamento.</li>
	<li>Flash-freeze tessuti utilizzando isopentano (2-metilbutano) refrigerato in un becher di acciaio circondato da azoto liquido. NOTA: L'isopentano raggiunge la temperatura ottimale per il congelamento dei tessuti quando iniziano a formarsi precipitati bianchi sui lati e sul fondo del becher13. L'isopentano viene utilizzato perché ha una conduttività termica più elevata rispetto all'azoto liquido, che aiuta a prevenire la fessurazione del blocco tissutale durante il congelamento rapido. Per una descrizione più dettagliata del congelamento del tessuto in OTC fare riferimento a Kumar et al.13.</li>
	<li>Avvolgere ogni stampo in un foglio premarcato e metterlo in un singolo sacchetto congelatore per evitare la disidratazione e conservare immediatamente su ghiaccio secco fino a quando non viene trasferito per la conservazione in un congelatore a -80 °C.</li>
</ol>3. Criosezione dell'emilaringe nel piano della sezione trasversale
<ol><li>Impostare la temperatura della camera nel criostato a -20 °C, che si trova nel mezzo dell'intervallo di temperatura (15-25 °C) raccomandato per il sezionamento del tessuto muscolare dal manuale del produttore.</li>
	<li>Impostare lo spessore della sezione criostato su sezioni spesse 10 μm. NOTA: per l'analisi della sezione trasversale delle fibre muscolari, le sezioni spesse 10 μm sono ottimali per consentire una colorazione completa e un'intensità di imaging robusta delle fibre muscolari etichettate per l'analisi della tipizzazione delle fibre14,15,16. Alcuni protocolli possono richiedere uno spessore di sezione diverso a seconda dei bersagli neuromuscolari.</li>
	<li>Trasferire i tessuti nella camera criostata, aggiungere uno strato uniforme di composto OCT sul disco del campione criostato (mandrino) e posizionare il blocco di tessuto incorporato sopra il composto OCT sul disco del campione. Per ottenere sezioni trasversali della piega vocale per l'analisi delle fibre muscolari tireoatenoidi (TA), apporre il campione al mandrino in modo che la cartilagine tiroidea ventrale sia rivolta verso la lama del criostato e la cartilagine aritenoide sia rivolta verso il disco del campione. NOTA: è fondamentale notare che questi punti di riferimento non sono visibili in questa fase, a causa del composto OCT che diventa bianco e opaco quando congelato. Questa mancanza di visibilità è il motivo per cui è fondamentale notare l'orientamento dell'emilaringe durante la fase di congelamento del flash.</li>
	<li>Tagliare il composto OCT facendo avanzare la testa del campione di 100 μm fino a quando appare la porzione ventrale della cartilagine tiroidea.</li>
	<li>Quindi tagliare e tracciare sezioni di 30 μm dall'inizio della cartilagine tiroidea fino a quando la lamina propria, i muscoli TA mediali e il muscolo TA laterale sono esposti. NOTA: i punti di riferimento laringei devono essere tracciati e annotati dall'inizio della cartilagine tiroidea ogni 100 μm per garantire che l'angolo di sezionamento non sia obliquo. La Figura 2 rappresenta i due insiemi di punti di riferimento laringei nel piano della sezione trasversale con ingrandimento 10x.</li>
	<li>Una volta raggiunto il muscolo TA target, raccogliere sezioni su vetrini caricati positivamente a 10 μm.</li>
	<li>Conservare le sezioni in PBS a 4 °C per trattenere l'umidità fino a quando non sono pronte per essere macchiate. NOTA: il tessuto fisso può essere conservato in PBS fino a una settimana a seconda del target IHC, mentre il tessuto non fissato deve essere immediatamente elaborato.</li>
</ol>4. Criosezione emilaringe nel piano longitudinale
<ol><li>Con la camera criostata nuovamente impostata a -20 °C, modificare lo spessore della sezione a 30 μm. NOTA: Per l'analisi NMJ, uno spessore del tessuto compreso tra 30-60 μm può essere utilizzato per catturare diversi NMJ completi all'interno dei muscoli laringei senza frammentazione del terminale nervoso o della piastra terminale del motore11,12,17.</li>
	<li>Per ottenere sezioni longitudinali della piega vocale per l'analisi NMJ del muscolo TA, apporre i campioni al mandrino in modo che l'epiglottide sia orientata verso la lama criostatale e il lume tracheale rivolto verso il basso verso il disco del campione.</li>
	<li>Tagliare il composto OCT facendo avanzare la testa del campione di 100 μm fino a quando appare la cartilagine tiroidea.</li>
	<li>Tagliare e tracciare sezioni di 30 μm dall'inizio della tiroide fino a quando la lamina propria e le divisioni mediali e laterali del muscolo TA sono esposte. NOTA: Si raccomandano cinque serie di punti di riferimento laringei nel piano longitudinale per tracciare la progressione della profondità del tessuto verso il muscolo TA target. La Figura 3 rappresenta i punti di riferimento laringei nel piano longitudinale con ingrandimento 10x.</li>
	<li>Una volta raggiunto il muscolo TA target, raccogliere sezioni su vetrini caricati positivamente a 30 μm.</li>
	<li>Conservare le sezioni in PBS a 4 °C per trattenere l'umidità fino a quando non sono pronte per essere macchiate.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La preparazione delle corde vocali dei ratti per l'analisi neuromuscolare può presentare varie sfide. Non solo i muscoli laringei sono piccoli e circondati da cartilagine, rendendo così difficile estrarre direttamente il muscolo bersaglio, ma è stata trovata anche un'elevata variabilità tra gli animali nella profondità dei punti di riferimento anatomici laringei. Per il muscolo il protocollo del piano della sezione trasversale, le sezioni complete della piega vocale sono apparse tra 21-85 sezioni (10 μm per sezione) dopo la comparsa iniziale della cartilagine tiroidea ventrale, che è un po 'meno delle sezioni 63-126 (35 μm per sezione) nel piano longitudinale per i protocolli di analisi NMJ (Tabella 1).
La variabilità è stata notata nelle distanze tra i punti di riferimento laringei nonostante l'incorporamento, l'orientamento e il sezionamento uniformi dei tessuti per ciascun tipo di protocollo. Inoltre, le differenze nel peso corporeo non hanno tenuto conto della variabilità nelle ampie gamme di profondità del tessuto da una serie di punti di riferimento laringei all'altro. Questa variabilità nella distanza tra i punti di riferimento laringei può essere dovuta a differenze individuali nell'anatomia laringea tra gli animali, piccole differenze nell'orientamento delle laringi nella criostampe all'interno del composto OCT al momento della dissezione, o come i campioni sono stati posizionati sul disco del campione all'interno del criostato durante il sezionamento (cioè la quantità di composto OCT posto sul disco del campione prima del montaggio o lievi differenze nell'angolo di posizionamento).
Con la consapevolezza che queste lievi differenze nella preparazione del campione possono portare a una sostanziale variabilità in profondità dei punti di riferimento del tessuto laringeo, è fondamentale che i ricercatori alle prime armi abbiano una mappa di riferimento da cui lavorare. I protocolli di studio delineati che definiscono i metodi per identificare i muscoli di interesse e prevenire le insidie del protocollo, come quelle delineate in questo documento, possono migliorare la riproducibilità e prevenire la perdita di tessuto indesiderata.
Sebbene questo studio si sia concentrato sul muscolo TA, questa metodologia è applicabile anche ad altri muscoli laringei intrinseci. Ad esempio, il sezionamento nel piano longitudinale della piega vocale produce sezioni longitudinali di fibre muscolari dei muscoli alare, TA laterale, TA mediale, cricoaritenoide laterale e cricoaritenoide superiore e sezioni trasversali dei muscoli cricoaritenoidi posteriori. Il sezionamento nel piano della piega vocale della sezione trasversale produce sezioni trasversali dei muscoli alari, TA laterali, TA mediale, cricoaritenoidi laterali, cricoaritenoidi superiori e cricotiroidei, nonché sezioni longitudinali dei muscoli cricoaritenoidi posteriori. Inoltre, sebbene questo studio non abbia incluso ratti femmina, le differenze tra ratti maschi e femmine nell'aspetto del punto di riferimento laringeo non sono attese perché il dimorfismo sessuale all'interno della laringe del ratto è specifico del muscolo e non correlato all'anatomia del quadro laringeo16,18.
La variabilità nella distanza tra i punti di riferimento laringei può rendere difficile la criosezione della piega vocale del ratto per gli investigatori alle prime armi. Questo studio ha dimostrato che, nonostante la coerenza nel modo in cui le laringi dei ratti sono state congelate, incorporate e criosezionate, la distanza tra i punti di riferimento laringei variava notevolmente; il peso degli animali non ha tenuto conto di questa variabilità. Questo studio fornisce procedure dettagliate con immagini associate su come preparare in modo appropriato il tessuto muscolare laringeo e identificare i punti di riferimento laringei per l'indagine istologica neuromuscolare della piega vocale del ratto.

La laringe di ratto è un modello consolidato per studiare gli adattamenti laringei neuromuscolari strutturali e funzionali allo sviluppo, all'invecchiamento, alla malattia e agli agenti farmacologici1,2,3,4,5. La coerenza dei metodi istologici è fondamentale per questa linea di lavoro, in quanto vi sono molteplici complessità coinvolte nella preparazione e nell'analisi muscolare, nonché sfide associate alle dimensioni laringee, alla forma e alla topografia dei muscoli incapsulati all'interno delle cartilagini laringee1,6,7,8,9,10,11 . A causa delle piccole dimensioni dei muscoli laringei intrinseci del ratto, l'incorporamento sistematico, il congelamento e la criosezione sono fondamentali per ottenere risultati coerenti e accurati. Ad esempio, quando si seziona la piega vocale del ratto nel piano coronale, le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di quattro dei muscoli laringei intrinseci si trovano a meno di 1,8 mm di profondità del tessuto11. Pertanto, il monitoraggio preciso dell'anatomia del muscolo laringeo durante la criosezione è indispensabile per identificare con precisione le sezioni di interesse e prevenire la sovraselezione del tessuto. La sovraselezione del muscolo bersaglio può comportare un'identificazione imprecisa del numero e della topografia di NMJs11 o può comportare riduzioni complessive delle dimensioni del campione se il muscolo bersaglio viene scartato a causa della confusione dell'orientamento del punto di riferimento12. Man mano che vengono sviluppati nuovi modelli per lo studio del muscolo laringeo e dei rispettivi adattamenti, le procedure operative standard sono essenziali per garantire che i risultati siano precisi, affidabili e riproducibili tra gli studi.
L'obiettivo di questo articolo è quello di dettagliare la preparazione della piega vocale del ratto per un'analisi longitudinale e trasversale ottimale. Vengono descritti metodi dettagliati utilizzati regolarmente nel nostro laboratorio per identificare i punti di riferimento muscolari target durante la criosezione. Sebbene metodi simili siano utilizzati in diversi laboratori, qui vengono forniti maggiori dettagli rispetto alla letteratura per garantire una replica affidabile e accurata quando implementata da sperimentatori alle prime armi. L'obiettivo di questo tutorial è quello di fornire una metodologia standard per la valutazione immunoistochimica (IHC) della piega vocale del ratto per migliorare la coerenza tra laboratori e indagini.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Lo scopo di questo tutorial è descrivere la preparazione della piega vocale del ratto per lo studio neuromuscolare istochimico. Questo protocollo delinea le procedure per la dissezione laringea del ratto, il congelamento flash e la criosezione delle corde vocali. Questo studio descrive come criosezionare le corde vocali sia sul piano longitudinale che su quello della sezione trasversale. Una novità di questo protocollo è il tracciamento laringeo durante la criosezione che garantisce un'accurata identificazione dei muscoli laringei intrinseci e riduce la possibilità di perdita di tessuto. Le cifre dimostrano la criosezione progressiva in entrambi i piani. Ventinove emi-laringi di ratto sono state criosezionate e tracciate dall'emergere della cartilagine tiroidea alla comparsa della prima sezione che includeva l'intera piega vocale. La piega vocale completa è stata visualizzata per tutti gli animali in entrambi i piani. C'era un'alta variabilità nella distanza dalla comparsa della cartilagine tiroidea alla comparsa della piega vocale completa in entrambi i piani. Il peso non era correlato alla profondità dei punti di riferimento laringei, suggerendo che la variabilità individuale e altri fattori legati alla preparazione dei tessuti possono essere responsabili dell'elevata variabilità nell'aspetto dei punti di riferimento durante il sezionamento. Questo studio descrive in dettaglio una metodologia e presenta dati morfologici per la preparazione della piega vocale del ratto per l'indagine neuromuscolare istochimica. A causa dell'elevata variabilità individuale, i punti di riferimento laringei devono essere monitorati attentamente durante la criosezione per prevenire la sovraselezione di tessuti e perdite di tessuto. L'uso di una metodologia coerente, compresa un'adeguata preparazione dei tessuti e la consapevolezza dei punti di riferimento all'interno della laringe del ratto, aiuterà con risultati coerenti in tutti gli studi e aiuterà i nuovi ricercatori interessati a utilizzare la piega vocale del ratto come modello per studiare i meccanismi neuromuscolari laringei.

I risultati rappresentativi facevano parte di un'indagine in corso sugli effetti dell'esercizio vocale sul sistema neuromuscolare laringeo. Ventinove ratti maschi Fischer 344/brown Norway (12 di 9 mesi, 17 di 24 mesi) sono stati pesati ed eutanasizzati con inalazione di CO2 seguita da una toracotomia bilaterale.
Le procedure hanno seguito il protocollo delineato per etichettare NMJ e dimensioni delle fibre dei muscoli TA laterali e mediali. La distanza tra i punti di riferimento laringei è stata monitorata sia in piano longitudinale che trasversale utilizzando muscoli laringei e cartilagini circostanti per determinare la progressione durante la criosezione (Tabella 1). Il monitoraggio è iniziato alla prima comparsa della cartilagine tiroidea in entrambi i piani direzionali. La Figura 2 illustra la comparsa di punti di riferimento laringei durante la criosezione della sezione trasversale in ordine temporale con la tiroide (Figura 2a,b) che appare prima del muscolo TA mediale e della lamina propria (Figura 2c,d). La Figura 3 illustra la comparsa di punti di riferimento laringei durante la criosezione longitudinale in ordine temporale con il muscolo alare (Figura 3a,b) che appare prima del muscolo TA mediale (Figura 3c,d) e della lamina propria (Figura 3e,f).
In entrambi i piani direzionali, le distanze tra i punti di riferimento variavano notevolmente per i singoli animali.
Il peso e le apparizioni dei punti di riferimento laringei hanno avuto correlazioni da deboli a moderate per i ratti giovani e correlazioni deboli per i ratti anziani (Tabella 2 e Tabella 3). Le distanze tra i punti di riferimento all'interno di ciascun piano erano da moderatamente a fortemente correlate per entrambe le fasce d'età, ma debolmente correlate tra i due piani di dissezione. Pertanto, la variabilità nell'aspetto del punto di riferimento non può essere spiegata dal peso o dalle variazioni individuali delle dimensioni della laringe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61327/61327fig01.jpg"> Figura 1: Una laringe di ratto tagliata dorsalmente in due tra le cartilagini aritenoidi (ArC). Il lato destro dell'emilaringe è annotato con punti di riferimento nel piano longitudinale (LZ1-LZ5) corrispondenti ai cinque punti di riferimento longitudinali nella Tabella 1. Il lato sinistro dell'emi-laringe è annotato con punti di riferimento nel piano della sezione trasversale (CZ1 e CZ2) che corrispondono rispettivamente all'inizio del muscolo TA laterale e all'intera sezione trasversale della piega vocale. VF = corda vocale, CrC = cartilagine cricoide, AlC = cartilagine alare e T1 = primo anello tracheale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61327/61327fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61327/61327fig02.jpg"> Figura 2: Due sezioni trasversali fotografate con ingrandimento 10x in campo luminoso (a destra) e nel canale fluorescente 488 (a sinistra) dopo l'immunocolorazione per la laminina per delineare le fibre muscolari. Le sezioni (dall'alto verso il basso) mostrano la progressione durante la criosezione in ordine temporale con la tiroide (a,b) che appare prima del muscolo TA mediale e alla lamina propria della corda vocale (c,d). ThC = cartilagine tiroidea, LTA = tireoaritenoide laterale e MTA = tireoaritenoide mediale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61327/61327fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61327/61327fig03.jpg"> Figura 3: Tre sezioni longitudinali fotografate con ingrandimento 10x in campo luminoso (a destra) e nel canale fluorescente 488 (a sinistra) dopo l'immunocolorazione per le giunzioni neuromuscolari. Le sezioni (dall'alto verso il basso) mostrano la progressione durante la criosezione in ordine temporale con il muscolo alare (a,b) che appare prima del muscolo TA mediale (c,d) e alla lamina propria (e,f) della piega vocale. AlC = cartilagine alare, ThC = cartilagine tiroidea, ArC = cartilagine aritenoide, LTA = tireoaritenoide laterale, MTA = tireoaritenoide mediale e SCA = cricoaritenoide superiore. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61327/61327fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Punti di riferimento longitudinali</td>
			<td>Media (deviazione standard) in μm</td>
			<td>Gamma in μm</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1. Tutte e tre le principali cartilagini (tiroide, alare, aritenoide) sono apparse con l'emergere di fibre muscolari</td>
			<td>1,591 (665)</td>
			<td>350–2,800</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. Sono comparsi muscoli cricoarytenoidi superiori (SCA), cricoarytenoid alar (ACA) e tireoarytenoid laterali (LTA)</td>
			<td>2,344 (591)</td>
			<td>91–3,500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">3. I muscoli ACA e LTA si sono estesi completamente senza frammentazione</td>
			<td>2,631 (532)</td>
			<td>1505–3,640</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">4. Cartilagine aritenoide ingrandita, ACA scomparsa, muscolo tireoaritenoide mediale (MTA) è emerso</td>
			<td>2,948 (606)</td>
			<td>1765–4,305</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">5. Target sezione completa della piega vocale: i muscoli LTA e MTA si sono estesi completamente senza frammentazione e lamina propria è emersa</td>
			<td>3,131 (542)</td>
			<td>2205–4410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Punti di riferimento trasversali</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1. È apparso il muscolo LTA</td>
			<td>303 (138)</td>
			<td>110–690</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. Il muscolo MTA è apparso ed era ~ 50% della dimensione LTA con chiara lamina propria ed epitelio notato.</td>
			<td>482 (167)</td>
			<td>210–850</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Distanze in μm dalla prima comparsa della cartilagine tiroidea a ciascun punto di riferimento laringeo durante la criosezione (n = 29).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">CSA</td>
			<td colspan="5">Longitudinale</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LTA</td>
			<td>MTA</td>
			<td>Cartilagini</td>
			<td>Alar/SCA</td>
			<td>LTA</td>
			<td>MTA</td>
			<td>LP</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CSA</td>
			<td>LTA</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MTA</td>
			<td>0.88</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Longitudinale</td>
			<td>Cartilagini</td>
			<td>0.42</td>
			<td>0.42</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alar/SCA</td>
			<td>0.57</td>
			<td>0.47</td>
			<td>0.77</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>LTA</td>
			<td>0.59</td>
			<td>0.47</td>
			<td>0.71</td>
			<td>0.98</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MTA</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.39</td>
			<td>0.72</td>
			<td>0.97</td>
			<td>0.98</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>LP</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.76</td>
			<td>0.96</td>
			<td>0.97</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Peso</td>
			<td>-0.55</td>
			<td>-0.35</td>
			<td>0.08</td>
			<td>-0.45</td>
			<td>-0.46</td>
			<td>-0.46</td>
			<td>-0.41</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Risultati della correlazione di Pearson tra il peso e la profondità dei punti di riferimento laringei nei piani trasversali (CSA) e longitudinali per i giovani ratti maschi. LTA = tireoaritenoide laterale, MTA = tireoaritenoide mediale, SCA = cricoarytenoide superiore e LP = lamina propria.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">CSA</td>
			<td colspan="5">Longitudinale</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LTA</td>
			<td>MTA</td>
			<td>Cartilagini</td>
			<td>Alar/SCA</td>
			<td>LTA</td>
			<td>MTA</td>
			<td>LP</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CSA</td>
			<td>LTA</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MTA</td>
			<td>0.9</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Longitudinale</td>
			<td>Cartilagini</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.33</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alar/SCA</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.73</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>LTA</td>
			<td>-0.06</td>
			<td>-0.04</td>
			<td>0.64</td>
			<td>0.96</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MTA</td>
			<td>-0.02</td>
			<td>-0.02</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.79</td>
			<td>0.84</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>LP</td>
			<td>-0.17</td>
			<td>-0.15</td>
			<td>0.52</td>
			<td>0.76</td>
			<td>0.85</td>
			<td>0.91</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Peso</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.13</td>
			<td>-0.24</td>
			<td>-0.07</td>
			<td>-0.15</td>
			<td>-0.15</td>
			<td>-0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Risultati della correlazione di Pearson tra il peso e la profondità dei punti di riferimento laringei nei piani della sezione trasversale (CSA) e longitudinale per i ratti maschi anziani. LTA = tireoaritenoide laterale, MTA = tireoaritenoide mediale, SCA = cricoarytenoide superiore e LP = lamina propria.

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per preparare le corde vocali dei ratti per lo studio neuromuscolare istochimico.

Preparazione della piega vocale del ratto per le analisi neuromuscolari

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.7K Views.  New York University School of Medicine. Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per preparare le corde vocali dei ratti per lo studio neuromuscolare istochimico.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Ricerca

Neuroscienze

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

Formazione mirata delle vocalizzazioni ultrasoniche in ratti anziani e Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

Infusione sottocutanea di neurotrofina 4 usando le pompe osmotiche o l&#39;iniezione muscolare diretta migliora i muscoli del laringe del ratto di invecchiamento

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Biologia dello sviluppo

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Un modello murino di cervicale lesioni del midollo spinale per studiare post-lesionale respiratoria neuroplasticità

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medicina

Stampa 3D di modelli di corde vocali in silicone multistrato

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Autore in primo piano: Progressi nella fabbricazione di modelli sintetici di corde vocali per applicazioni fonetiche e robotiche

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Processo di produzione per modelli di corde vocali super-morbide non adesive

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Ingegneria

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Valutazione in vivo delle proprietà meccaniche e viscoelastiche del linguaggio del ratto

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

Preparazione della piega vocale del ratto per le analisi neuromuscolari

Riepilogo

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Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Un modello murino di cervicale lesioni del midollo spinale per studiare post-lesionale respiratoria neuroplasticità

Processo di produzione per modelli di corde vocali super-morbide non adesive

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Processo di produzione per modelli di corde vocali super-morbide non adesive

Valutazione in vivo delle proprietà meccaniche e viscoelastiche del linguaggio del ratto

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