Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla fosforilazione dell'estremità a cinque primi del DNA o delle molecole di RNA da una speciale classe di enzimi noti come polinucleotide chinasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ha la risoluzione di rilevare cambiamenti molto piccoli nei substrati di DNA e RNA. Inizia preparando le reazioni dell'enzima RNA chinasi.
Per ogni reazione, combinare un microlitro di 500 substrati di RNA nanomolare. 8,3 microlitri di 130 nanomolari l'ultimo, GRC tre e 0,2 microlitri di edta millimolare. Impostare il blocco di calore su 37 gradi Celsius.
Quindi mescolare 0,5 microlitri di un sotto stock ATP della serie di concentrazione con una miscela enzimatica di RNA e posizionare la reazione sul blocco termico. Continuare a mescolare le reazioni e posizionarle sul blocco termico a intervalli di dieci secondi. Dopo un'incubazione di 60 minuti sul blocco termico, dissetare ogni reazione spiking con 10 microlitri di colorante di carico dell'urea.
Eseguire immediatamente l'analisi a valle o memorizzare le reazioni a -20 gradi Celsius da analizzare in un secondo momento. Per preparare una soluzione di gel di acrilammide denaturante al 15%, combinare 22,5 millilitri di pre-miscelato 40%29 con una soluzione di acrilammide/bis acrilammide. Sei millilitri di dieci x TBE.
28,8 grammi di urea. E rnasi acqua libera ad un volume totale di 59 millilitri. Quindi mescolare delicatamente la soluzione.
Riscaldare la soluzione nel microonde per 20 secondi. Mescolarlo e restituirlo immediatamente al microonde per altri 20 secondi. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea non è completamente sciolta.
Posizionare il becher di vetro in un bagno d'acqua poco profondo, contenente acqua fredda per cinque minuti, assicurandosi che il livello di acqua fredda che circonda il becher di vetro sia superiore al livello della soluzione all'interno del becher di vetro. Quando la soluzione è fredda, filtrarla e de-gasarla con un'unità di filtrazione monouso da 0,2 micrometri per rimuovere particolato e microscopiche bolle d'aria. Lavare una lastra di vetro corta e lunga con acqua e sapone, quindi spruzzare ogni piastra con etanolo al 95% e pulire il vetro per rimuovere l'umidità.
Eleva la piastra lunga dal piano del banco posizionandolo sopra una scatola. Quindi posizionare distanziati di 0,4 millimetri lungo i lunghi bordi della piastra. Posare la piastra corta sopra la piastra lunga, assicurandosi che i bordi della piastra corta, della piastra lunga e dei distanziale siano allineati.
Quindi bloccare ogni lato con tre morsetti metallici distanziati uniformemente. Aggiungere 24 microlitri di TEMED alla soluzione di acrilammide e mescolarlo. Quindi aggiungere 600 microlitri del 10%APS e versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.
Versare la soluzione di acrilammide tra il sandwich di piastra di vetro può essere davvero impegnativo. Per evitare bolle d'aria, toccare il sandwich di piastra di vetro mentre si versa la soluzione. Aggiungere con cura un pettine pulito da 32 porsi sulla parte superiore del sandwich della piastra di vetro.
E lasciare che l'acrilammide polimerizzi per 30 minuti. Per eseguire il gel, impostare il blocco di calore su 75 gradi Celsius. Rimuovere i morsetti metallici.
E lavare e asciugare accuratamente il sandwich della piastra di vetro. Posizionare il sandwich piastra e l'apparato gel con la piastra corta rivolta in avanti e preparare il tampone di funzionamento 0,5 X TBE combinando 100 millilitri di 10 X TBE con 1,9 litri di acqua libera RNasi. Aggiungere 600 millilitri del tampone di corsa alle camere superiore e inferiore dell'apparecchio.
Rimuovere delicatamente il pettine dal gel e sciacquare accuratamente i pozzi con una siringa. Pre-eseguire il gel a 50 Watt per 30 minuti. Quindi risciacquare di nuovo i pozzi.
Post spin le reazioni di tempra e incubarle a 75 gradi Celsius per tre minuti. Ripetere lo spin dell'impulso e caricare immediatamente 10 microlitri di ogni campione sul gel. Quindi eseguire il gel per tre ore a 50 Watt.
Al termine della corsa, spegnere l'alimentatore e scaricare la camera superiore dell'apparecchio. Lavare e asciugare il lato esterno del sandwich della piastra di vetro. Quindi coprirlo con un foglio e trasferirlo su uno scanner laser per l'imaging.
Montare il sandwich della piastra di vetro sul palco dello scanner laser. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per il pavimento desiderato e l'immagine del gel. Qui è mostrato un gel di denaturazione rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa dell'ultimo complesso GRC three.
L'aggiunta di enzima ha portato all'ultima scissione mediata dell'RNA del Saccharomyces cerevisiae ITS due substrati di RNA, portando a un frammento di RNA definito. Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da GrC3 PNK. Per visualizzare la fosforilazione del frammento di RNA C2, la quantità relativa di RNA C2 non fosforilato e fosforilato è stata tracciata rispetto alla concentrazione di ATP.
Il nostro gel di denaturazione rappresentativo non riuscito è mostrato qui. Il substrato di RNA nucleotidico 21 conteneva prodotti di degradazione, che si sovrapponevano al prodotto fosforilato e rendevano impossibile quantificare accuratamente la fosforilazione. Al contrario, il prodotto di degradazione dell'RNA più breve poteva essere analizzato con successo perché quest'area del gel non conteneva altre specie di RNA che ostacolavano una quantificazione accurata della sua controparte fosforilata.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo è sciacquare i pozzi del gel per garantire un caricamento uniforme del campione. Seguendo questa procedura, potrebbe essere eseguito un esperimento di turnover dell'RNA. Per misurare i tassi di degradazione dell'RNA, la fosforilazione spesso segnala l'inizio della degradazione dell'RNA.
Questa tecnica apre la strada per rispondere a domande dettagliate sulla specificità delle attività e sulla cinetica delle chinasi polinucleotidiche.
