Questo lavoro è stato supportato dal budget principale del p53lab (BMSI, A*STAR) e dalla sovvenzione VIP JCO (A*STAR).

La linea cellulare HEK293 è stata utilizzata per il protocollo ed è stata coltivata nel Medium Aquila Modificata di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 100 U/mL penicillina/streptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO2 in un ambiente umidificato.
1. Valutazione quantitativa dell'interruzione complessa del FEI4F tramite il saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646
<ol><li>Coltura cellulare e transitoria transitoria del saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646<ol>
<li>Utilizzare cellule appena scongelate con meno di 20 passaggi per tutti gli esperimenti. Il primo giorno, determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle standard e contare le celle vitali totali utilizzando il metodo di esclusione blu Trypan13.</li>
		<li>Piastre seme 6-po 'con 0,9 - 1,2 x 106 di cellule HEK 293 per pozzo in 2 mL di mezzo di crescita standard. NOTA: Al fine di ottenere la migliore efficienza di trasfezione all'interno delle linee cellulari sopra indicate, assicurarsi che le cellule placcate siano confluenti al 70-90% il giorno dopo la semina.</li>
		<li>La mattina del secondo giorno, co-trasfezionare le cellule con subA-eIF4E ed eIF4G604-646-SubB plasmide utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica (vedi Tabella dei materiali)come descritto di seguito.<ol>
<li>Diluire 9 μL di soluzione a base di liposoma in un tubo contenente 125 μL di mezzo siero ridotto senza rosso fenolo (vedi Tabella dei materiali)per ogni trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
			<li>Preparare la miscela master di DNA diluire 3 μg di ogni plasmide in 125 μL di mezzo siero ridotto per ogni tubo di trasfezione.</li>
			<li>Aggiungere 12 μL di reagenti enhancer al tubo mix master dna, mescolare bene e aggiungere immediatamente il DNA: enhancer master mix ad ogni tubo di liposomi diluiti in un rapporto 1:1. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
			<li>Aggiungere il complesso DNA-lipidico ad ogni pozzo e incubare le cellule in un incubatore di 37 °C con 5% di CO2 per 24 ore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La mattina del giorno 3, sciacquare ogni bene con 1 mL di PBS.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e incubare le cellule in ogni pozzo con 0,3 mL di tripside per 5 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Neutralizzare la tripparina aggiungendo 2 ml del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS in ogni pozzo e trasferire le cellule trasfette in un tubo da 15 ml. NOTA: Il rosso fenolo può interferire con l'attività della luciferasi; pertanto, le cellule devono essere maneggiate da questo passo in poi in mezzo senza rosso fenolo.</li>
		<li>Spin down celle per 5 min a 290 x g e aspirare il mezzo. Rimossare le cellule in 2 mL del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Contare come descritto nel passaggio 1.1.</li>
		<li>I semi hanno trasfetto cellule HEK 293 in 96 piastre ben opache ad una densità di 30.000 cellule per pozzo in 90 μL di mezzo senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Al fine di ottenere 3 repliche tecniche all'interno dello stesso esperimento per 3 composti diversi, seme 60 pozzi delle piastre con cellule escluse i pozzi sui bordi.</li>
		<li>Subito dopo la semina delle cellule trasfette, aggiungere 10 μL di soluzione composta DMSO al 10% (vedere fase 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione composta<ol>
<li>Preparare soluzioni di stock composto da 1 mM sciogliendo il composto di interesse in DMSO al 100% (v/v). Per avere 3 repliche per ogni titolazione composta, utilizzare 8 μL della soluzione di stock composto da 1 mM. NOTA: Il volume di 1 mM di composto stock utilizzato è superiore a quello necessario. Questo viene fatto per tenere conto degli eventuali errori di pipettazione.</li>
		<li>Eseguire una diluizione seriale di 2 volte della soluzione di composto stock con 4 μL del materiale da 1 mM in 4 μL di DMSO al 100% per ogni punto di titolazione. NOTA: Per una titolazione composta completa, eseguire 9 diluizioni seriali dal materiale iniziale in DMSO al 100%. Se è necessario testare più composti, utilizzare una piastra di pozzo 96 e una pipetta multicanale per facilitare questo passaggio e le successive diluizioni.</li>
		<li>Aggiungere 36 μL di acqua sterile di grado HPLC per ogni punto della diluizione seriale 2 volte per preparare un 40 μL di soluzioni di lavoro 10x in DMSO al 10% (v/v) (cioè Da 100 μM a 0,39 μM 10% serie di scorte DMSO porterà a una soluzione finale da 10 μM a 0,039 μM, in 1% DMSO se aggiunto alle cellule). Per quanto riguarda il controllo del trattamento, preparare anche una soluzione stock solo DMSO al 10% in acqua sterile di grado HPLC.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di soluzioni di lavoro 10x alle celle della piastra ben opaca 96 al fine di ottenere la concentrazione finale prevista con una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 100 μL e incubare per 3 h a 37 °C con 5% v/v COatmosferica 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Test di complementazione luciferasi e fattibilità<ol>
<li>Dopo 3 ore di farmaco, iniziare a preparare il reagente del substrato di luciferasi combinando 1 volume di substrato con 19 volumi del reagente di diluizione (vedere le istruzioni del produttore). NOTA: Il saggio luciferasi viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere immediatamente 25 μL di reagente del substrato.</li>
		<li>Agitare la piastra a 350 giri/min per 50 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.</li>
		<li>Valutare la luminescenza utilizzando un lettore di lastre. Per fare ciò, impostare il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 455. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s.</li>
		<li>Per valutare la vitalità delle cellule, aggiungere 33 μL di reagente di dosaggio di vitalità e quindi rimescolare nuovamente la luminescenza dopo 15 minuti a temperatura ambiente, utilizzando il lettore di piastre.</li>
		<li>Valutare la luminescenza con il lettore di lastre impostando il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 600 nm. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s. NOTA: La vitalità viene valutata misurando il livello intracellulare di ATP sullalisi cellulare secondo le istruzioni del produttore. Il multiplexing è possibile in questo caso poiché il saggio di fattibilità utilizza una luciferasi diversa con una diversa lunghezza d'onda di emissione.</li>
		<li>Utilizzate i dati per determinare i valori IC50 di ogni composto per curva adattando i dati a un'equazione della curva di raccordo a 4 parametri: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D I valori numerici D e A devono essere vincolati nel processo di raccordo della curva: D = valore luminescente sull'asse Y per un asintoto di curva minimo o un livello teorico minimo di risposta previsto dal saggio di complementazione eIF4E:4G. A = valore luminescente sull'asse Y per l'asintoto della curva massima o la massima risposta teorica al livello prevista dal saggio di completamento eIF4E:4G. NOTA: Il valore per la risposta minima è derivato dal trattamento di controllo DMSO (v/v) dell'1% e il valore per la risposta massima deriva dalla risposta massima di un inibitore mTOR ad alta affinità che si è stabilizzato senza alcun effetto sulla vitalità cellulare.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Correlare l'inibizione del saggio eIF4E:eIF4G604-646 con interruzione complessa del fei4F nelle cellule
<ol><li>Confermare che il segnale misurato dal saggio corrisponde all'interruzione fisica dell'interazione eIF4E-eIF4G da parte del composto, cellule di semi come descritto al passaggio 1.1.</li>
	<li>Il giorno dopo, sostituire il mezzo con 1 mL di mezzo siero ridotto non contenente rosso fenolo e incubare per 4 ore con il composto di interesse. Assicurare una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 1 mL. NOTA: Per consentire facilmente una correlazione con il risultato, utilizzare concentrazioni composte all'inizio, al punto medio e all'estremità della curva di titolazione del saggio di complementazione misurata.</li>
	<li>Le celle Lyse ed eseguite m7GTP si abbassano per isolare i complessi eIF4F ed eIF4E:4EBP1. Procedure dettagliate su come eseguire l'esperimento pull down m7GTP possono essere trovate altrove14.</li>
	<li>Rilevare i livelli di proteine m7GTP bound eIF4G, eIF4E e 4EBP1 mediante analisi western blot, quindi correlare con l'interruzione del complesso eIF4F con l'inibizione del segnale di dosaggio di complementazione.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descritto in questo articolo utilizza un saggio di complementazione basato sulla luciferasi per monitorare quantitativamente l'assemblaggio complesso eIF4F attraverso la misurazione diretta dell'interazione eIF4G-eIF4E nelle cellule vive. Abbiamo fornito dettagli per l'uso del sistema di completamento eIF4E-eIF4G e abbiamo anche dimostrato che il sistema è estremamente accurato nella misurazione della dissociazione mediata da 4EBP1 indotta da farmaci dell'interazione eIF4E-eIF4G16. Al fine di facilitare la produttività di questo saggio, la configurazione sperimentale descritta in questo articolo è stata progettata per un utilizzo in formato micropiatta a 96 pozzi.
Per risultati ottimali, due passaggi critici devono essere considerati quando si esegue il saggio. In primo luogo, l'efficienza di trasfezione tra gli esperimenti dovrebbe rimanere simile. Questo può essere garantito attraverso l'uso di celle a basso numero di passaggi e contando rigorosamente le cellule il giorno della semina. La confluenza cellulare deve anche essere valutata prima che venga effettuata la trasfezione del DNA, in quanto non è consigliabile trasffezionare le cellule con reagente di trasfezione a base lipidica se la confluenza cellulare è inferiore al 70-90%. In secondo luogo, è importante multiplexare il saggio di complementazione con un saggio di vitalità cellulare. Alcuni composti possono influire sul segnale luciferasi principalmente diminuendo il numero di cellule vitali attraverso effetti deleteri. È pertanto importante misurare la vitalità della cellula immediatamente dopo il saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646 per affrontare gli effetti fuori bersaglio e non specifici.
Le interfacce proteina-proteina, come quella tra eIF4E ed eIF4G, prive di fessure idrofobiche e relativamente grandi e planari, sono generalmente considerate "non farmacogabili" dalle terapie convenzionali a piccole molecole (<500 MW)17. Pertanto, c'è un crescente interesse per lo sviluppo di nuove modalità che interagiscono efficacemente con questo tipo di superfici (ad esempio, composti macrociclici e peptidomimetici). Tuttavia, molte di queste nuove modalità non sono innatamente in grado di attraversare la membrana cellulare e coinvolgere il loro bersaglio. Per aggirare questi problemi, molti gruppi di ricerca stanno conducendo ricerche su nuove strategie di ottimizzazione chimica e consegna cellulare. Immaginiamo che il saggio PPI eIF4E:eIF4G604-646 a cellule vive e altri saggi derivati da PPI simili svolgeranno un ruolo fondamentale nel promuovere queste strategie e convalidarle.

Il controllo dell'espressione genica gioca un ruolo fondamentale nella corretta esecuzione di programmi cellulari come la proliferazione e la differenziazione della crescita. Un meccanismo di controllo normativo può essere esercitato sia a livello di trascrizione genica che a livello di traduzione dell'mRNA. Nell'ultimo decennio, è diventato sempre più evidente che il controllo traslazionale per modulazione del processo di iniziazione piuttosto che le fasi successive di allungamento e terminazione possono regolare finemente la sintesi di sottoinsiemi specifici di proteine che svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche.
Una maggiore traduzione degli mRNA coinvolti nella sopravvivenza, nelle risposte anti-autofagiche e anti-apoptotiche è stata implicata in diversi tumori e sono state anche causalmente collegate all'attivazione aberrante o all'espressione sovraesperienza dei fattori di iniziazionealla traduzione 1.
Il complesso eIF4F è un regolatore principale dell'avvio della traduzione. Legando la struttura del limite alla fine dei 5' mRNA, eIF4F sta guidando il reclutamento iniziale di mRNA-ribosoma e, a sua volta, aumentando l'efficienza di traduzione dell'mRNA degli mRNA eucariotidebolmente tradotti 2. La traduzione mediata da eIF4F di mRNA correlati al cancro è stata segnalata per molti modelli di cancro che ospitano l'attivazione aberrante delle vie RAS/MAPK o AKT/TOR, suggerendo che le cellule tumorali upregolano eIF4F per aumentare la propria attività pro-neoplastica. L'interruzione di questo ciclo feed-forward inibendo la formazione complessa eIF4F è quindi una strategia terapeuticamolto promettente 3,4.
Il complesso eIF4F è costituito da (i) eIF4E, la subunità di legame con il tappo di eIF4F che interagisce con la struttura del cappuccio trovata al 5' UTR di mRNA, (ii) eIF4A, l'RNA elicase e (iii) eIF4G, la proteina dell'impalcatura che interagisce sia con eIF4A che con eIF4E e che alla fine recluta la subunità ribosomiale 40S5. L'associazione eIF4G con eIF4E è il passo limitante della velocità per l'assemblaggio di complessi eIF4F funzionali ed è regolata negativamente dalle proteine leganti eIF4E (4EMP, membri 1, 2 e 3))6. Competendo con l'associazione eIF4G a eIF4E attraverso un'interfaccia costituita da sequenze di associazione eIF4E canoniche e non canoniche7,8,9 (regione compresa tra aa 604-646 sull'eIF4E umano), 4EBP riduce il pool di eIF4E attivamente coinvolti nella traduzione e impedisce la formazione complessa eIF4F. L'interazione di queste interazioni proteina-proteina è regolata principalmente dal bersaglio dei mammiferi della fosforilazione mediata dalla rapamicina (mTOR) di 4EBP. Su stimoli mitogenici, mTOR fosforilati direttamente i membri della famiglia proteica 4E-BP, diminuendo la loro associazione con eIF4E e, quindi, promuovendo l'interazione eif4E-eIF4G e la formazione di complessi funzionali eIF4F10.
Nonostante il grande sforzo nello sviluppo di composti mirati all'integrità complessa di eIF4F, la mancanza di saggi che misurano l'interruzione diretta dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive ha limitato la ricerca di composti colpiti attivi cellulari. Abbiamo applicato un saggio di luciferasi basato su un analogo coelenterazina (ad esempio, test di complementazione basato su Nanoluc) per monitorare in tempo reale lo stato dell'integrità eIF4F attraverso l'interazione eIF4E-eIF4G. Il sistema proteico di complementazione della luciferasi è costituito da un frammento proteico da 18 kDa (SubA) e 11 frammenti di peptide amminoacido (SubB) ottimizzati per un'auto-associazione minimae stabilità 11. Una volta espresse come prodotto di fusione con l'eIF4E a figura intera umana e il dominio di interazione eIF4E di eiF4G1 umano (aa 604-646), le due proteine interagenti porteranno il frammento SubA e SubB in prossimità l'una dell'altra e indurranno la formazione della luciferasi attiva che, in presenza di un substrato permeabile cellulare, alla fine genererà un segnale luminoso luminescente (Figura 1). Abbiamo segnalato altrove la costruzione e la convalida del sistema di complemento eIF4E:eIF4G604-646 16.
Qui descriviamo come il sistema di complementazione eIF4E:eIF4G604-646 (disponibile su richiesta) può essere applicato per misurare con precisione l'interruzione eIF4E-eIF4G mediata da 4EBP1 nelle cellule vive. Inoltre, dimostriamo la sua utilità misurando gli effetti di diversi inibitori mTOR che sono attualmente in fase di sperimentazione clinica come potenziali farmaci terapeutici contro ilcancro 12. Poiché gli effetti off-target spesso mascherano l'attività specifica del farmaco, descriviamo anche come la versatilità della misurazione del sistema eIF4E:eIF4G604-646 può essere estesa con misurazioni ortogonali della vitalità cellulare per tenerne conto.

<table><tbody><tr><td>293FT cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Cell titer Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>not applcable</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;L3000015&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Eppendorf</td><td>not appicable</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP (C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

La formazione del complesso eIF4F ha dimostrato di essere il nodo chiave a valle per la convergenza delle vie di segnalazione che spesso subiscono l'attivazione oncogenica nell'uomo. eIF4F è un complesso di legame cap coinvolto nella fase di reclutamento mRNA-ribosoma dell'iniziazione alla traduzione. In molti modelli cellulari e precli clinici di tumori, la deregolamentazione dell'eIF4F porta a una maggiore traduzione di specifici sottoinsiemi di mRNA coinvolti nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. eIF4F è un complesso etero-trimerico costruito dalla subunità eIF4E legante il tappo, dall'elisocca eIF4A e dalla subunità di impalcature eIF4G. Fondamentale per l'assemblaggio di complessi attivi eIF4F è l'interazione proteina-proteina tra proteine eIF4E ed eIF4G. In questo articolo viene descritto un protocollo per misurare l'assembly eIF4F che monitora lo stato dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle celle vive. Il saggio di interazione proteina-proteina a base cellulare eIF4e:4G consente inoltre di valutare in modo accurato e affidabile i cambiamenti indotti dai farmaci nell'integrità complessa di eIF4F. Immaginiamo che questo metodo possa essere applicato per verificare l'attività dei composti disponibili in commercio o per un ulteriore screening di nuovi composti o modalità che interrompono in modo efficiente la formazione del complesso eIF4F.

Al fine di convalidare la sensibilità del sistema di complementazione eIF4E:eIF4G604-646, l'inibizione mediata 4EBP1 dell'assemblaggio complesso eIF4F è stata valutata utilizzando inibitori mTOR. Inibendo la fosforilazione dipendente dalla chinasi mTORC1 della famiglia di proteine 4EBP, l'inibizione mTOR migliora l'associazione 4EBP1 all'eIF4E e, quindi, allo smontaggio eIF4F15. Sono state testate due classi di inibitori meccanisticamente diversi delle mTOR chinasi: rapalog (ad esempio Rapamicina) che sono inibitori allosterici di mTORC1 ma non mTORC2 e inibitori competitivi dell'ATP (ad esempio, PP242) che sono progettati per inibire specificamente sia l'attività catalitica della chinasi mTORC1 che mTORC2.
Le cellule HEK293 sono state trasfette con il sistema di completamento eIF4E:eIF4G604-646 come descritto al passaggio 1. Dopo 24 ore di trasfezione, le cellule sono state ri-seeded e trattate con gli inibitori mTOR PP242 e rapamicina (come descritto nel passaggio 1.2). Quattro ore dopo il trattamento, è stata valutata la luminescenza, come descritto in precedenza, seguita dalla vitalità cellulare. Come mostrato nella figura 2, PP242 produce un'inibizione dose-dipendente del segnale con un IC50 calcolato di 0,72 ± 0,04 μM, mentre un IC50 di 6,88 ± 0,88 μM è derivato per la rapamicina (Figura 2A). Le piastre sono state quindi multiplexate per il saggio di vitalità cellulare(figura 2D). Questa analisi mostra che né pp242 né rapamicina producono una significativa diminuzione della vitalità cellulare, dimostrando che la diminuzione della luminescenza nel sistema di completamento eIF4E:eIF4G604-646 non è dovuta alla morte cellulare aspecifica, ma piuttosto all'interruzione dell'interazione eIF4E:4G.
Un esperimento pull down m7GTP eseguito incubando cellule non trasfette con concentrazioni composte che corrispondono ai punti iniziale, medio e finale della curva di titolazione misurata nella figura 2A mostra che l'interruzione mediata da 4EBP1 dell'interazione endogena eIF4E-eIF4G è correlata al segnale di dosaggio misurato eIF4E:eIF4G604-646 ( Figura2B, 2C). Coerentemente con questi risultati, pp242 si dimostra essere un inibitore più potente della fosforilazione totale 4EBP1 rispetto alla rapamicina nelle condizioni sperimentali testate nelle cellule HEK 293 (Figura 3A), mentre entrambi gli inibitori hanno mostrato un impatto sulla segnalazione mTOR normalmente, con la rapamicina più attiva contro i substrati mTORC1 e PP242 che mira sia a mTORC1 che a mTORC2(figura 3B).
Nel loro insieme, questi risultati hanno dimostrato che il PP242 è più efficace nel interrompere la formazione complessa di eIF4F rispetto alla rapamicina nelle cellule HEK293 e dimostrano inoltre che il sistema eIF4E:eIF4G604-646 è in grado di misurare con precisione l'assemblaggio complesso eIF4F nelle cellule viventi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Figura 1: sistema di completamento eIF4E:eIF4G604-646. La rappresentazione schematica che mostra come l'interazione delle fusioni proteina X (eIF4E) e proteina Y (eIF4G604-646)consenta alle fusioni SubA e SubB di entrare in prossimità l'una con l'altra e ricostituire la luciferasi attiva. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Figura 2: Interruzione mediata da 4EBP1 del complesso eIF4F. (A) PP242 e rapamicina eIF4E:eIF4G604-646 titolazione del saggio che modella l'interazione tra eIF4E ed eIF4G in cellule HEK 293 trasfette. (B,C) Analisi western blot che mostra il livello endogeno di eIF4E, eIF4G e 4EBP1 negli estratti hek 293 e in m7GTP tirare giù dopo l'incubazione di cellule coltivate con diversa concentrazione di PP242 o Rapamicina rispettivamente. (D) Cellule trattate in A in cui sono state valutate multiplexate per la vitalità cellulare e la luminescenza. Tutti i valori rappresentano ± SD (n=3). Questa cifra è stata modificata da16. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Figura 3: Effetto differenziale dell'inibizione mTOR sulla foshorylation 4EBP1. (A) Analisi western blot dello stato di fosforilazione di 4EBP1 in cellule HEK293 non trasfette trattate con concentrazione indicata di PP242 e rapamicina. (B) Analisi western blot dello stato di fosforilazione AKT e S6 in cellule HEK293 non trasfette trattate con i doppi inibitori del sito attivo MTORC1/2 PP242 o l'inibitore allosterico della rapamicina mTORC1. Beta actin è stato visualizzato per il controllo del carico così come totale 4EBP1, AKT e S6. Questa cifra è stata modificata da16. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Views.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Ricerca

Genetica

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biochimica

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologia

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunologia e infezioni

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A High Resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Riepilogo

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Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

Identificazione delle proteine partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

A High Resolution metodo per monitorare l'attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

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