Questo protocollo illustra come analizzare la secrezione di cellule utilizzando l'imaging dal vivo mediante microscopia TOF e fornisce strumenti per rilevare eventi di clustering o aree ad alta attività. Utilizzando questo protocollo, possiamo generare colture cellulari su superfici micropattern che normalizzano la divisione cellulare e quindi facilitano le gamme speciali di eventi secretori. Le cellule secernono una varietà di macromolecole che svolgono ruoli importanti nella regolazione immunitaria.
Nel cancro, la secrezione deregolamentata influisce sul rilascio di enzimi proteolitici che facilitano l'invasione. La quantificazione della secrezione ci permetterà di comprendere meglio la secrezione degradata nel cancro e in altri processi dinamici come la presentazione dell'antigene. Sebbene il nostro protocollo di imaging e analisi sia semplice, richiede la generazione di singole cellule che sono ben distribuite su un pezzo di micropattern.
In questo video, dimostreremo come colturare le cellule su coverlips micropattern e come visualizzare e analizzare eventi secretori utilizzando strumenti statistici spettri. Per preparare le coverlips per il micropatterning, attivare le coperture in vetro sterilizzato con etanolo di 25 millimetri sotto la luce ultravioletta profonda per cinque minuti. Durante l'attivazione dei copripavimenti, aggiungere una goccia di 30 microliter di polietilene glicole per coverslip innesto di polilisina su un pezzo di pellicola di paraffina all'interno di una camera umida.
Al termine dell'attivazione, posizionare i coperchi attivati lato superficiale verso il basso sulle gocce e coprire la camera umida per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le coverlips due volte in acqua distillata. Mentre le coverlips si asciugano, lavare una maschera fotografica al quarzo una volta con acqua distillata e una volta con alcol.
Asciugare la maschera fotografica con flusso d'aria filtrato ed esporre il lato cromato della maschera fotografica fino alla luce ultravioletta profonda per cinque minuti. Al termine dell'illuminazione, aggiungere una goccia d'acqua di 10 microliter sul lato cromato di ogni maschera fotografica e posizionare il lato glicole polietilene di ogni coverslip su ogni goccia d'acqua. Dopo aver rimosso l'acqua in eccesso, posizionare una copertura del film sugli scivoli per evitare la disidratazione.
Esporre i lati rivestiti non cromati delle maschere fotografiche alla luce ultravioletta profonda per altri cinque minuti prima di aggiungere acqua in eccesso alle maschere fotografiche per rimuovere i copriparsi. Questo passaggio produrrà le impronte del micropattern sulla superficie. Quindi incubare le coverlips in una soluzione proteica a matrice extracellulare su pellicola di paraffina in una camera umida per un'ora sotto una cappa di flusso laminare.
Per la semina cellulare sulla superficie del micropattern preparata, al termine dell'incubazione, posizionare le coverlips in un lato micropattern del portapelli magnetico verso l'alto e aggiungere immediatamente il supporto del motivo ai copripavimenti. Dopo aver aggiunto la guarnizione, immobilizzare le coverlips con il dispositivo magnetico prima di riempire il portascipelli con un mezzo di motivo aggiuntivo. Quindi chiudere il supporto con un coperchio di vetro.
Quando le cellule sono pronte, aggiungere 5 per 10 al 5 ° delle cellule epiteliali del pigmento retinici immortalato trasfettato alle copertine e incubare le cellule nel supporto per 10 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per aspirare il vecchio mezzo mentre si utilizza una seconda pipetta per lavare le cellule cinque volte con mezzo fresco per lavaggio per rimuovere le cellule non attaccate e qualsiasi siero bovino fetale residuo. Dopo l'ultimo lavaggio, riportare il supporto nell'incubatrice per tre ore per consentire la diffusione completa della cella.
Per l'immagine degli eventi di esocitosi, posizionare il portapenne sotto un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale e cercare una cellula che esprima VAMP7-pHluorina completamente diffusa. Modificare l'angolo del laser fino a raggiungere un angolo totale di fluorescenza di riflessione interna che consenta la visualizzazione degli eventi di esocitosi VAMP7-pHluorina ed eseguire un'acquisizione di cinque minuti a una frequenza compatibile con la velocità di esocitosi e la scala cronologica. Per ottenere le coordinate dell'esocitosi, aprire il filmato dell'evento di esocitosi acquisito nelle Figi e identificare manualmente gli eventi di esocitosi con la comparsa di un segnale luminoso che si diffonde verso l'esterno.
Utilizzate lo strumento punto per contrassegnare il centro dell'evento di esocitosi e utilizzate l'analisi e la misura per misurare le coordinate x e y e la coordinata temporale. Salvare le misure di una cella in un file di testo. Aprire un file di testo in un foglio di calcolo e rimuovere tutte le colonne delle coordinate x e y tranne la sezione.
Quindi, utilizzare lo strumento ovale e misurare per misurare il centro e il diametro e ottenere le coordinate x e y e il diametro di Feret di ogni cella. Salvare le misure di tutte le celle in un unico file di testo. Aprite il file di testo in un foglio di calcolo e rimuovete tutte le colonne di diametro delle coordinate x e y tranne x e y.
Quindi aggiungere la misurazione del raggio per ogni cella, quindi ottenere il raggio dal diametro del Feret per ogni cella. Utilizzate lo strumento linea retta per misurare lo spessore dell'anello di micropattern di ogni cella. Salvare questa misurazione per tutte le celle in un unico file di testo, quindi dividere la lunghezza dell'adesione per il raggio della cella per calcolare la lunghezza di adesione normalizzata.
Per l'analisi spaziale a cella singola, installare innanzitutto il pacchetto di RStudio e caricare il pacchetto in RStudio. Eseguire il pacchetto con la funzione ESA. Si aprirà un'interfaccia utente, quindi la directory per i file TXT del dataset e una directory per i grafici di output.
Lo script inizierà ed eseguirà automaticamente l'analisi, fornendo file PDF dei grafici corrispondenti e file TXT contenenti i risultati numerici. All'interno della cellula, il pavimento in sonda viene spento dal basso pH del gliosoma, ma durante l'esocitosi, la pHluorina inizia a emettere un segnale all'aumentare del pH a causa del rilascio di protoni. Il segnale di pHluorina mostra un picco durante l'esocitosi che rappresenta il rilascio rapido di protoni lisosomiali, seguito da un decadimento esponenziale del segnale che rappresenta la diffusione 2D della sonda nella membrana plasmatica.
Tipicamente, le cellule epiteliali pigmentate della retina immortalate dall'uomo dimostrano un'importante attività di secrezione lisosomiale con un tasso medio di esocitosi di 0,28 Hertz. È possibile visualizzare la distribuzione 2D dell'esocitosi per stima della densità del kernel per rivelare differenze nelle densità locali. Ci sono tre possibili deviazioni dalla casualità spaziale completa: clustering, dispersione o una miscela di clustering e dispersione.
La funzione K di Ripley può essere usata per valutare queste deviazioni. Da notare che gli eventi di esocitosi nell'area non adesiva sono anche raggruppati indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che inducono hotspot secretori nelle membrane plasmatiche. Tracciare l'istogramma degli eventi di esocitosi in base al modulo per una cella rappresentativa rivela un picco intorno al confine tra le aree adesive e non adesive.
L'analisi accoppiata dimostra che la densità superficiale è inferiore nell'area di adesione rispetto all'area di non adesione, potenzialmente a causa della forte diminuzione dell'esocitosi alla periferia cellulare. Combinare l'adesione cellulare su micropattern con l'analisi statistica facilita la capacità di individuare come processi cellulari complessi come la secrezione sono regolati nello spazio. Sono necessari ulteriori lavori futuri per determinare quale meccanismo molecolare sia alla base del raggruppamento dell'attività secretoria.
