Il sequenziamento dell'mRNA a singola cellula è ampiamente usato per comprendere i processi biologici a un singolo livello cellulare. L'avvento delle strategie di multiplexing ha ulteriormente ampliato le sue amplificazioni consentendo la profilazione di più campioni in un unico esperimento, riducendo drasticamente i costi ed evitando gli effetti batch. A dimostrare la procedura saranno Wei Feng, un postdoc, e Andrew Przysinda, un tecnico del mio laboratorio.
Dopo il conteggio, dividere le cellule isolate dal giorno embrionale 18,5 camere cardiache in cinque volte 10 alla quinta aliquota e lavare le cellule due volte con PBS fresco per lavaggio. Resuspend i pellet in 180 microlitri di PBS per campione e aggiungere 20 microlitri di soluzione stock di codici a barre di ancoraggio a ciascun tubo con miscelazione delicata. Dopo un'incubazione di cinque minuti sul ghiaccio, aggiungere 20 microlitri di soluzione di stock di codici a barre di co-ancoraggio a ciascun tubo con miscelazione delicata per un'ulteriore incubazione di cinque minuti sul ghiaccio prima di lavare le celle tre volte con un millilitro di PBS freddo integrato con albumina di siero bovino all'1% per lavaggio, quindi filtrare i campioni in nuovi tubi attraverso un colino cellulare di 40 micrometri per tubo.
Dopo il conteggio, assemblare il chip B in un supporto per chip, quindi aggiungere 75 microlitri di una soluzione di glicerolo del 50% ai pozzi inutilizzati nella prima fila, 40 microlitri ai pozzi inutilizzati nella seconda fila e 280 microlitri ai pozzi inutilizzati nella terza fila. Si noti che qui viene utilizzato un chip di training per dimostrare la procedura. Aggiungere il volume appropriato di sospensione cellulare e acqua priva di nucleasi alla miscela principale con pipettazione delicata.
Aggiungere 75 microlitri della soluzione cellulare risultante al centro inferiore del campione ben in fila uno senza bolle. Vortice le perline di gel per 30 secondi prima di aggiungere lentamente 40 microlitri di perline al centro inferiore del tallone gel ben in fila due senza bolle. Aggiungere 280 microlitri di olio divisorio lungo la parete laterale del pozzo dell'olio divisorio nella terza fila.
Attaccare la guarnizione al truciolo senza premere verso il basso sulla guarnizione e mantenere la guarnizione orizzontale per evitare di bagnare la guarnizione. Caricare il chip assemblato con la guarnizione nel controller del cromo ed eseguire il programma B a cella singola al cromo. Si noti che lo schermo mostra l'allenamento del cromo per il chip di allenamento, ma per gli esperimenti reali lo schermo mostrerà il cromo a singola cella B.Una volta completato il programma, rimuovere immediatamente il chip e scartare la guarnizione.
Piegare il coperchio indietro per esporre i pozzi con un angolo di 45 gradi e controllare i livelli di liquido per assicurarsi che non siano presenti zoccoli. Aspirare lentamente 100 microlitri di perline di gel in emulsione dai punti più bassi del pozzo di recupero e controllare l'uniformità delle perline. Distribuire le perline emulsionate lungo la parete di un nuovo tubo PCR sul ghiaccio e posizionare il tubo in un ciclore termico per la trascrizione inversa.
Per preparare il cDNA per l'amplificazione, aggiungere 125 microlitri di agente di recupero al campione a temperatura ambiente. Non deve essere osservato alcun liquido opaco ed evitare pipettazione o vortice. Attendere 60 secondi prima di rimuovere lentamente l'agente di recupero dal fondo del tubo e aggiungere 200 microlitri di miscela di pulizia del tallone del vortice al campione.
Pipettare la miscela 10 volte prima di incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, posizionare i campioni su un magnete in posizione elevata. Quando la soluzione si sgomberà, rimuovere il supernatante e aggiungere 200 microlitri di 80% di etanolo al pellet.
Dopo 30 secondi, rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare brevemente il campione e posizionare il tubo sul magnete in posizione bassa per consentire al campione di asciugarsi all'aria per meno di due minuti. Quando il campione si è asciugato, rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 35,5 microlitri di soluzione di eluizione preparata al momento.
Dopo un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, posizionare il campione sul magnete in posizione elevata fino a quando la soluzione non si libera prima di trasferire 35 microlitri del campione su una nuova striscia di tubo. Per l'amplificazione cDNA utilizzando la strategia di codifica a barre a base lipidica, aggiungere la miscela di reazione di amplificazione ai campioni di cDNA a 35 microliter con miscelazione accurata prima di centrifugarsi brevemente. Al termine dello spin, incubare il campione nel ciclore termico seguendo l'appropriata procedura di amplificazione cDNA.
Aggiungere 120 microlitri di reagente selezionato e 100 microlitri di acqua ultrapura a 100 microlitri di campione e pipettare il reagente selezionato 0,6x risultante 15 volte. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare il campione sul magnete fino a quando la soluzione non diventa chiara. Trasferire il supernatante su un tubo a bassa legatura da 1,5 millilitri per la costruzione di una libreria cDNA con codice a barre multiplexing.
Ricordarsi di salvare sia i supernatanti che la base mentre il contenuto del supernatante assembla cDNA con codice a barre e il contenuto di base cDNA endogeno. Pulire il cDNA endogeno con l'80% di etanolo ed eludere il DNA con 40 microlitri di tampone di eluizione, quindi eseguire un controllo di qualità del cDNA endogeno prima di preparare una libreria di trascrizione endogena. La concentrazione di cDNA deve essere quantificata e qualificata prima della costruzione della biblioteca.
Anche le librerie costruite, comprese le librerie endogene cDNA e codici a barre, dovrebbero essere quantificate e qualificate prima del sequenziamento. Dopo il sequenziamento, l'espressione del codice a barre può essere analizzata in ogni singola cella. Ad esempio, in questa analisi sono stati osservati otto gruppi di singole celle che esprimevano in modo univoco un tipo di codice a barre che rappresentava celle di otto campioni diversi.
Inoltre, alcune celle non esprimevano alcun codice a barre e quindi erano definite come celle negative, mentre altre celle esprimevano due diversi codici a barre che rappresentavano i doppietti. Usando le cellule singole, l'eterogeneità cellulare e le regolazioni molecolari potrebbero essere valutate per annotazione del tipo di cellula, identificazione di tipi di cellule nuove e rare, analisi comparativa della zona anatomica e analisi delle vie di ontologia genica, come le separazioni di fase del ciclo cellulare. È utile immaginare le perline di gel in emulsione se possibile, poiché un'immagine ti dirà se la procedura ha avuto successo fino a questo punto.
Il multiplexing di esempio aggiunge grande flessibilità nella progettazione degli esperimenti. Dopo aver visto questa dimostrazione, spero che sarai più sicuro di iniziare i tuoi esperimenti.
