Questo protocollo può aiutare a mantenere la stabilità del carico, che può essere sia piccole molecole che proteine, attraverso l'uso della polibola, che a sua volta può ridurre le interazioni di carbonio con il solvente. Questa nuova tecnica può essere utilizzata per migliorare la copertura vaccinale nei paesi in via di sviluppo in quanto le funzionalità vaccinale possono spesso essere compromesse a causa di strutture di trasporto e stoccaggio inefficienti. Per fabbricare le polibolle, utilizzare prima una pipetta di trasferimento millilitro per aggiungere 800 microlitri di 10%CMC in una fiala di vetro da 0,92 millilitro.
Per sintetizzare PCLTA, mescolare 1.000 grammi per millilitro di PCL da 14 kilodalton in 200 microlitri di DCM. Per sintetizzare PLGADA, mescolare 1.000 grammi per millilitro di cinque kilodalton PLGADA in 200 microlitri di cloroformio. Mescolare il fotoiniziotore con la miscela polimerica di interesse con un rapporto da 0,005 a 1 e caricare 200 microlitri della soluzione risultante in una siringa di vetro millilitro montata su una pompa di siringa collegata a un tubo di acciaio inossidabile di erogazione con un diametro interno di 0,016 pollici.
Utilizzando un micromotore per controllare il movimento avanti e indietro del tubo polimerico, iniettare il polimero nel 10%CMC nel flaconcino di vetro per formare le polibolle e curare le polibolle sotto la luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 254 nanometri per 60 secondi a due watt per centimetro quadrato, quindi flash congelare le polibolle in azoto liquido per 30 secondi e liofilizzare i portatori durante la notte a 0,01 millibar sotto vuoto in meno 85 gradi Celsius. Per centrare il carico di interesse all'interno di una polibubble, mescolare il carico con il 5%CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico prima di iniettare manualmente due microlitri della miscela di carico nella polibubble. Quando tutto il carico è stato iniettato, ri-curare, congelare il flash e liofilizzare la polibola iniettata come appena dimostrato.
La mattina seguente, utilizzare le forcep per separare la polibola dal CMC essiccato e lavare la polibola con acqua deionizzata per rimuovere eventuali CMC residui. Quindi tagliare la polibolletta a metà e immagini le metà con microscopia confocale per assicurarti che il carico sia centrato. Per il rilascio di carichi di piccole molecole, incubare le polibolle con acriflavina centrata in 400 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius per l'appropriata lunghezza di incubazione.
Ad ogni momento sperimentale, raccogliere il supernatante e aggiungere 400 microlitri di PBS fresco al flaconcino. Quindi utilizzare un lettore di piastre per quantificare l'intensità di fluorescenza del supernatante raccolto. Per l'attivazione nel vicino infrarosso, mescolare la soluzione polimerica con nano aste d'oro idrofobicizzate con un rapporto uno a nove e aggiungere l'iniziatore fotografico con un rapporto da 0,005 a 1.
Iniettare la miscela risultante in una fiala di vetro da 0,92 millilitri contenente 800 microlitri del 10%CMC e curare le polibolle sotto la luce ultravioletta, come dimostrato. Dopo il congelamento del flash e la liofilizzazione come dimostrato, lavare le polibolle con acqua deionizzata e incubare i portatori in 400 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius per l'appropriato periodo di incubazione. Al termine dell'incubazione, ottenere un'immagine infrarossa lungimirante della polibolla prima e dopo aver attivato le polibolle con un laser vicino all'infrarosso da 801 nanometri a otto ampere per cinque minuti tre volte a settimana per quattro settimane per le polibolle PLGADA e 14 settimane per i polibolli PCL-PCLTA.
Ad ogni momento sperimentale, raccogliere il supernatante e aggiungere 400 microlitri di PBS fresco al flaconcino. Quindi calcola le differenze di temperatura tra le polibolle prima e dopo l'attivazione laser in base ai valori di temperatura delle immagini infrarosse lungimiranti. L'aggiunta di una soluzione acquosa basata su CMC al 10% si traduce in una sospensione completa in polibolle per una manutenzione efficace della sfericità polibubble.
L'iniezione di carico nel polibolle in assenza di CMC si traduce in perdite e una conseguente mancanza di ritenzione del carico all'interno della polibola. Per far fronte a questa perdita, la viscosità del PCLTA può essere aumentata utilizzando carbonato di potassio isolato dopo il polietilene di tappatura finale con triacrilato e la viscosità del carico può essere aumentata mescolando il carico con il 5%CMC. La viscosità delle polibolle PLGADA è sufficiente per facilitare la centratura del carico e non richiede modulazione tramite carbonato di potassio.
Si noti che non si osserva alcuna differenza statisticamente significativa nell'efficienza di legame dell'anticorpo dopo aver miscelato l'antigene HIV gp120/41 con e senza trealosio prima dell'iniezione di polibolle. I rilasci di scoppio ritardato sono osservati nelle polibolle PLGADA con acriflavina nel mezzo il giorno 19 per polibolle incubate a 37 gradi Celsius e il quinto giorno per polibolle incubate a 50 gradi Celsius. Inoltre, le polibolle PLGADA e le polibolle PCL e PCLTA contenenti nano aste d'oro possono essere attivate con successo al laser più volte.
Quando si formano le polibolle, si prega di fare attenzione a proteggere i reagenti dalla luce e anche di utilizzare immediatamente le soluzioni. Dopo aver sviluppato questa tecnologia, volevamo anche esplorare l'automazione di questo processo per arne la scala nella produzione di polibolle.
