هذا البروتوكول سوف تظهر لك كيفية وصمة عار microglia، وإجراء تحليل الكثافة الكمية والمورفولوجيا، وكذلك لتحديد حجم تسلل الضامة في الدماغ. هذه التقنية تسمح للباحث لقياس التغيرات في توزيع microglia والمورفولوجيا بطريقة كمية ولتمييز microglia من اختراق الضامة هذا بروتوكول التحليل يمكن تطبيقها بسهولة على نماذج الحيوانات الأخرى لقياس التغيرات في التوزيع microglial والمورفولوجيا حيث تتوفر الأجسام المضادة المضادة IBA1 و ANTI-TMEM119. ينصح بشدة لإجراء تعداد الخلايا وآثار أعمى لحالة تجريبية وتكون متسقة في الطريقة التي يتم بها تنفيذ هذا الإجراء.
لبدء هذا الإجراء، افتح برنامج معالجة صورة مثل Fiji أو ImageJ يحتوي على أقرب مسافة جارة المكونات الإضافية المثبتة. افتح صورة 20X إذا كان المقياس موجودًا في بيانات التعريف للملف ولم يتم تعيينه تلقائيًا من بيانات التعريف. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين مقياس، ثم أدخل المعلومات الصحيحة.
لتعيين المقياس يدويًا استنادًا إلى مقياس مطبوع على الصورة، حدد أداة الخط المستقيم. ضع المؤشر على حافة المقياس، وأثناء الضغط على مفتاح Shift، قم برسم خط أقرب ما يمكن إلى المقياس على الصورة. حدد تحليل، تعيين مقياس.
سوف يطفو على النافذة ووضع الصحيح المسافة المعروفة وحدة الطول لتحديد بكسل لكل وحدة طول وانقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد صورة، لون، جعل مركب لإنشاء صورة مركبة من جميع القنوات. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين القياسات. تحقق من المنطقة، الوسطى والمحيط.
في القائمة المنسدلة إعادة توجيه إلى، حدد فتح الملف ثم انقر فوق موافق. انتقل إلى الصورة، اللون، أداة القناة لفتح أداة القناة. استخدم أداة اختيار حر لرسم محيط تقريبي حول المنطقة ذات الاهتمام. انقر نقراً مزدوجاً فوق الأداة البيضاوية على شريط الأدوات لتمكين أداة الفرشاة التحديد.
تأكد من تحديد المربع تمكين فرشاة التحديد ثم انقر فوق موافق. باستخدام فرشاة التحديد، ضبط محيط لتناسب أفضل المنطقة من الفائدة، ثم اضغط على T على لوحة المفاتيح في جميع أنحاء هذه المنطقة إلى السهم مدير Y. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M والنوافذ النتائج سوف يطفو على المنبثقة. انسخ النتائج ولصقها في ورقة بيانات واحفظ المعلومات المتعلقة بالمنطقة.
بعد نسخ المنطقة التي تهمك، يمكنك إسناد المعلومات من نافذة النتائج بالنقر فوقه والضغط على مفتاح Backspace. حدد نافذة مدير ROI، وحدد تتبع العائد على الاستثمار وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر فوق موافق ثم انقر على حق الاسم الجديد من تتبع ROI وحفظ.
انقر نقراً مزدوجاً فوق أداة فرشاة في شريط الأدوات. حدد اللون الأسود وحجم الفرشاة 10. تأكد من أن الخيار "الرسام" على التراكب غير محدد.
في قناة TMEM119، ضع نقطة سوداء بعناية على مركز سوما لكل ميكروجليا إيجابية TMEM119. ضع نقطة بيضاء على وسط الخلايا غير إيجابية لـ TMEM119. كرر نفس الإجراء لكافة الخلايا الموجودة في منطقة الاهتمام.
بعد ذلك، حدد صورة، لون، قناة سبليت، ستظهر نافذة لكل قناة. تحديد القناة التي تحتوي على التعليقات التوضيحية نقطة وإغلاق الإطارين الآخرين. لإعادة توجيه صورة قناة الانقسام الجديدة، انتقل إلى تحليل، تعيين القياسات.
في القائمة المنسدلة إعادة التوجيه إلى، حدد صورة قناة الانقسام وانقر فوق موافق. ثم حدد صورة، اكتب، ثمانية بت. انتقل إلى ضبط الصورة وحدد العتبة. ضبط المتزلجون على طول الطريق إلى اليسار في كلا الشريطين.
هذا سوف يترك فقط النقاط السوداء التي سوف تظهر الآن بيضاء. حدد المنطقة التي تهمك في نافذة مدير عائد الاستثمار. في شريط القوائم، حدد تحليل، تحليل الجسيمات.
في مربع النص لحجم إدخال واحد إلى 20. يجب أن يظل مربع وحدات Pixel غير محدد بينما يجب تحديد المربع الذي يعرض نتائجه، تلخيص وإضافة إلى المدير. انقر فوق موافق لعرض إطار الملخص الذي سيعطي عدد النقاط.
نسخ هذه المعلومات ولصقها على ورقة البيانات. ثم، حدد المكونات الإضافية NND لإظهار نافذة NND. كل رقم يمثل المسافة التي لكل microglia لديه إلى أقرب microglia المجاورة.
نسخ ولصق كافة هذه المعلومات إلى ورقة البيانات. العودة إلى نافذة عتبة وضبط المنزلق أعلى على طول الطريق إلى اليمين، والتي سوف تترك كل من النقاط البيضاء مرئية، والآن تظهر بيضاء. حدد تحليل، تحليل الجسيمات لعرض تحليل الجسيمات المنبثقة نافذة.
انقر فوق موافق لإظهار إطار الملخص الذي يوفر عدد النقاط. نسخ هذه المعلومات ولصقها في ورقة البيانات. انتقل إلى مدير ROI وحدد جميع النقاط.
ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحفظ مع اسم الصورة. سيسمح هذا بحفظ كافة النقاط في ملف ZIP. أولاً، افتح ملفات الصور 4DX.
ستظهر نافذة منبثقة تسألك عما إذا كان يجب فتح الصور في كومة. انقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد صورة، مكدسات، ZProject لفتح نافذة الإسقاط Z. وتشمل جميع شرائح من الشريحة الأولى حتى الماضي.
تأكد من تحديد الحد الأقصى كثافة ضمن نوع الإسقاط وانقر فوق موافق. انقر على النافذة الجديدة التي تحتوي على ZProject. اختر الصورة والألوان وقنوات الانقسام وقم بإجراء الآثار على صور قناة IBA1. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين القياسات.
تحقق من المنطقة، الوسطى والمحيط. في القائمة المنسدلة إعادة توجيه إلى، حدد الملف المفتوح وانقر فوق موافق. لتعيين المقياس يدويًا استنادًا إلى مقياس مطبوع على الصورة، حدد أداة الخط المستقيم. ضع المؤشر على حافة المقياس، وأثناء الضغط على مفتاح Shift، قم برسم خط أقرب ما يمكن إلى المقياس على الصورة.
حدد تحليل، تعيين مقياس. نافذة ستظهر إدخال المسافة الصحيحة المعروفة ووحدة الطول لتحديد بكسل لكل وحدة طول وانقر فوق موافق. لقياس حجم سوما في قناة IBA1، قم برسم محيط تقريبي لـ soma باستخدام أداة التحديد الحر.
انقر نقراً مزدوجاً فوق الأداة البيضاوية على شريط الأدوات لتمكين أداة فرشاة التحديد. تأكد من تحديد المربع تمكين فرشاة التحديد ثم انقر فوق موافق. باستخدام فرشاة التحديد، ضبط التتبع لتناسب أفضل سوما. يؤدي التكبير إلى تمكين الدقة أثناء هذه الخطوة.
بعد ذلك، اضغط على المفتاح T لإضافة تتبع سوما إلى مدير ROI. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M لعرض النتائج. نسخ ولصق هذه النتائج إلى ورقة بيانات.
انتقل إلى نافذة مدير ROI، وحدد المنطقة التي تهمك وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة التي تمت إعادة تسميتها من الفائدة وانقر حفظ. تأكد من أن الاسم يحدد أن التتبع هو سوما وحفظ الملف.
لقياس منطقة التربيع في قناة IBA1، حدد أولاً أداة تحديد المضلع. انقر على أقصى عملية microglial مع أداة لبدء شكل المضلع. الذهاب حول microglia عن طريق النقر على نصائح من كل طرف عملية لتشكيل المضلع الذي يمثل أفضل المنطقة التي تغطيها arborizations microglial.
عند اكتمال المضلع، انقر على نقطة البداية لإغلاقه. ثم اضغط على المفتاح T لإضافة التتبع إلى مدير ROI. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M لإضافة البيانات إلى نافذة النتائج.
نسخ هذه البيانات ولصقها في ورقة البيانات. لحفظ المعلومات المتعلقة بمنطقة التربيع، انتقل إلى نافذة مدير ROI، وحدد المنطقة ذات الأهمية وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة التي تمت إعادة تسميتها من الفائدة وانقر حفظ.
تأكد من أن الاسم يحدد أن التتبع هو لـ التعقب وحفظ الملف. وصفت هذه الدراسة سير العمل خطوة بخطوة لتلوين مُناعي مشترك من IBA1 و TMEM119 و لتحليل كثافة الميكروفلالي، والتوزيع، والمورفولوجيا وكذلك من تسرب الخلايا النخاعية الطرفية في أنسجة الدماغ الماوس. يستخدم المجهر الفلوري لتصوير العلامات المشتركة من microglia باستخدام IBA1 و TMEM119 في القسم التاجي من الحصين الظهري في التكبير 20X.
يكشف تلطيخ ناجح عن أجسام الخلايا الصغيرة وعملياتها الدقيقة. يسمح تلطيخ لتحديد كثافة وتوزيع microglial وتحديد مجموعات microglial والتسلل الضامة. يستخدم المجهر Confocal لتصوير الإجراء تتبع المبور المجهرية خطوة في التكبير 40X.
تظهر هذه النتائج التمثيلية IBA1 إيجابية و TMEM119 microglia إيجابية وكذلك مثال على تتبع الجسم الخلية. من المهم أن تكون متسقة عند عد الخلايا وإيلاء الاهتمام لكل من إشارات IBA1 و TMEM119. هذه التقنية تسمح للباحث لتحديد مناطق الدماغ التي تتأثر بحافز معين والتي يمكن بعد ذلك دراسة أكثر تعمقا مع تقنيات تكميلية.
