Il nostro protocollo fornisce un metodo ad alta produttività per vagliare un gran numero di interazioni microbiche a coppie in tandem per identificare interazioni di interesse che possono aiutare la ricerca sul microbioma e la scoperta antimicrobica. Questo metodo è facilmente applicabile allo studio delle interazioni microbiche in una varietà di sistemi, purché i microrganismi siano amabili alla coltura in condizioni di laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli utenti di schermare un gran numero di interazioni microbiche in un periodo di tempo relativamente breve.
I nuovi utilizzatori di questa tecnica dovrebbero prendere tempo, specialmente quando inoculano le piastre di dosaggio biologico, in quanto è fondamentale fare attenzione a ridurre al minimo la crescita troppo o la contaminazione. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, perché l'inoculazione delle piastre di dosaggio biologico richiede precisione per garantire che gli organismi non sopravvivano i pozzi e che le co-colture non siano contaminate. Inizia preparando culture notturne.
Utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere tre millilitri di brodo BHI in tubi di coltura da 14 millilitri. Quindi utilizzare un ciclo sterile inoculante di un microlitro per inoculare una colonia batterica nel brodo. Ruotare il loop per assicurarsi che il ciuffo si disperde nel brodo.
Vortice brevemente i tubi di coltura e incubarli durante la notte a 37 gradi Celsius su uno shaker a 250 giri/min. Una volta che le colture batteriche raggiungono un OD 600 sopra uno, vortice per rompere i ciuffi delle cellule. Preparare i supporti PHI con l'1,5% di agar e sterilizzarli in autoclave.
Quindi raffreddare il supporto a 55 gradi Celsius in un bagno d'acqua a temperatura controllata e distribuire tre millilitri di supporti BHI fusi in ciascuno dei 12 pozzi su una piastra, assicurando che i pozzi siano il più uniformemente possibile. Quindi lasciare che l'agar si metta durante la notte. Inoculare l'organismo di prova su una piastra di dosaggio biologico inserendo un ciclo sterile di inoculazione a 10 microlitri nella coltura notturna e striando bene la goccia di coltura sul terzo sinistro di un piatto.
Ripetere fino a quando tutti i 12 pozzi sul piatto sono stati inoculati. Incubare le piastre capovolte alla temperatura appropriata per sette giorni. Se si incuba a temperature superiori o uguali a 37 gradi Celsius o in climi più secchi, conservare le piastre in un contenitore umido per evitare che si asciughino.
Dopo sei giorni di incubazione della piastra di bioassay, preparare colture notturne dell'organismo bersaglio come descritto in precedenza. Preparare la piastra bersaglio riempiendo ogni pozzo di una piastra vuota da 12 pozzi con 1,8 millilitri di BHI e 200 microlitri della coltura notturna target. Posizionare un timbro di inoculazione sterile nella piastra di destinazione.
Ruotare delicatamente le colture intorno ai pozzi, assicurando che non attraversi i pozzi vicini. Sollevare il timbro di inoculazione e assicurarsi che su ogni punta del timbro sia presente una goccia di coltura bersaglio diluita. Posizionare il timbro di inoculazione su una piastra di bioassay non iniculata e scuotere delicatamente il timbro in modo che la goccia di coltura inoculi ogni bene.
Una volta rimosso il timbro, una goccia di cultura dovrebbe essere visibile nei pozzi. Se alcuni pozzi non sono inoculati con il timbro di inoculazione, individuare tre microlitri di coltura notturna diluita sui pozzi utilizzando una pipetta. Quindi inoculare le piastre di bioassay come descritto in precedenza, ma allineare le punte del timbro con il lato destro della piastra da 12 pozzi, assicurando che il timbro non contatti la colonia batterica esistente.
Rimuovere con cura il timbro e riposizionare di nuovo nella piastra di destinazione. Se l'agar si è solidificato nei pozzi in modo non uniforme, scuotere delicatamente il timbro avanti e indietro, ma fare attenzione a non spostare il timbro nella crescita dell'organismo di prova. Ripetere l'inoculazione per ogni piastra di dosaggio biologico fino a quando tutte le piastre non vengono inoculate, quindi incubare le piastre capovolte alla temperatura appropriata per sette giorni.
Dopo aver co-coltivato il test e l'organismo bersaglio per una settimana, segnare le interazioni in base alla valutazione visiva. Segna i pozzi con la crescita dell'organismo bersaglio che mostra una crescita indistinguibile dalla monocoltura come zero. Segna i pozzi con una crescita diminuita come una, e nessuna crescita come due.
I test di co-coltura qui descritti sono stati utilizzati per valutare l'attività inibitoria degli organismi di prova degli actinobatteri verso gli organismi bersaglio della specie stafilococco isolati dalla cavità nasale umana. Sono state testate complessivamente 812 combinazioni a coppie. In particolare, il Corynebacterium propinquum ha fortemente inibito gli stafilococchi negativi della coagulasi, in particolare rispetto ad altri Corynebacteria che hanno debolmente inibito gli stafilococchi negativi della coagulasi o non hanno avuto effetti inibitori.
Attraverso l'uso della genomica comparativa, un ammasso genico biosintetico per la produzione di siderofori è stato identificato nel genoma del Corynebacterium propinquum. I test di interazione di co-coltura utilizzando un mezzo BHI standard e integrato in ferro hanno determinato che il fenotipo di inibizione tra Corynebacterium propinquum e stafilococchi negativi della coagulasi era in realtà dipendente dal ferro. È importante fare attenzione quando si timbra la piastra.
Ricontrollare ogni bene dopo la timbratura e assicurarsi che il timbro di inoculazione sia allineato correttamente per prevenire la contaminazione. Dopo aver identificato le interazioni di interesse, studi successivi che utilizzano genetica e genomica microbica, isolamento e caratterizzazione naturale del prodotto o spettrometria di massa di imaging possono essere utilizzati per caratterizzare i meccanismi alla base di queste interazioni. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per scoprire la competizione mediata dal sideroforo tra il microbiota nasale umano, e aiutato nella scoperta di una nuova molecola antimicotico chiamata cifomicina.
