La co-immunoprecipitazione multipla quantitativa, o QMI, consente agli utenti di misurare simultaneamente centinaia di interazioni binarie in una rete di interazione proteica predefinita. Eseguendo più co-PIC contemporaneamente nello stesso lisato, le tecniche bioinformatiche possono quindi esaminare come cambiano i gruppi di co-associazioni in modo coordinato. Il test richiede molto tempo per essere sviluppato, ma una volta che il pannello QMI è in corso, i dati sulla scala di rete possono essere raccolti sui sistemi di trasduzione del segnale in un saggio relativamente semplicemente overnight.
QMI richiede l'accurata pipettazione di diversi campioni e reagenti in 96 piastre di pozzo. Quando si impostano ed eseguono ogni saggio, è necessario prendere appunti accurati per evitare errori. Per la preparazione del campione e l'immunoprecipitazione, iniziare lisciviando il campione in un detergente adatto con inibitori della proteasi e della fosfatasi per un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio.
Al termine dell'incubazione, far girare il campione per rimuovere le membrane e i detriti ed eseguire un test BCA sul supernatante per determinare la concentrazione proteica secondo protocolli standard. Dopo aver normalizzante le concentrazioni proteiche, preparare un mix di perline magnetiche che contiene circa 250 perline magnetiche di ogni classe per pozzo. Utilizzare la separazione magnetica per lavare la miscela di perline magnetiche due volte nel buffer Fly P prima di rimescolare le perline in 20 microlitri di tampone Fly P per campione.
Dopo un'accurata pipettazione, aliquote 20 microlitri di perline in un tubo di microcentrifugo ghiacciato per campione e aggiungere volumi uguali di lysate con concentrazioni proteiche normalizzate a ciascun tubo per l'immunoprecipitazione. Quindi dividere ogni campione di lisato in un unico tubo per ogni piastra in esecuzione e immunoprecipitare i campioni su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte protetti dalla luce. La mattina seguente utilizzare un rack magnetico perline per rimuovere il lisato dal primo set di tubi e lavare le perline due volte in 500 microlitri di tampone Fly P ghiacciato per lavaggio.
Dopo aver calcolato il volume di resuspensione, resospensione degli immunopreciti nel volume calcolato del tampone Fly P ghiacciato. Riprendodere accuratamente le perline magnetiche con una delicata pipettazione e distribuire 25 microlitri di perline per pozzo su una piastra piatta con fondo 96 poggiale sul ghiaccio. In una diversa piastra di pozzo 96, diluire con anticorpi sonda anattinilati ad una concentrazione di lavoro due volte superiore.
Utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 25 microlitri di ogni diluizione dell'anticorpo della sonda nei pozzi appropriati della perla magnetica contenente la piastra di dosaggio e agitare ad alta velocità su uno shaker orizzontale per mescolare e rimpioderare le perline magnetiche. Dopo la miscelazione, ridurre la velocità per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con tampone Fly P fresco per lavaggio su una rondella magnetica a quattro gradi Celsius.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le perline in 50 microlitri di streptavidina PE diluiti uno a 200 nel tampone Fly P. Agitare il mix e rimostrare le perline prima di incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 30 minuti protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con tampone Fly P su una rondella magnetica a quattro gradi Celsius e rimescolare le perline in 125 microlitri di tampone Fly P.
Agitare la piastra per un minuto a 900 rotazioni per risospendire accuratamente le perline e caricare la piastra in un citometro a flusso perfezionato. Nel software del citometro a flusso, selezionare l'impostazione Target RP1 alta, una condizione di arresto di 1.000 perline per regione e un volume di campioni di 80 microlitri. Mettere in pausa la corsa a metà strada e rimpiorsi le perline per evitare la sedimentazione.
Alla fine dell'esecuzione esportare i file di dati nel formato XML. Per eseguire l'analisi ANC, compilare il file di input ANC per riflettere i dettagli della progettazione sperimentale ed eseguire il programma, che scriverà un file CSV in Active Directory. File che termina con i riscontri.
csv segnalerà le co-associazioni proteiche che sono significativamente diverse a un livello falso positivo di 0,05 tra il controllo e le condizioni sperimentali in almeno tre repliche sperimentali su quattro. Per l'analisi ponderata della rete di correlazione, incollare i titoli delle colonne del file di dati output di Matlab terminando in mfi. csv nella prima colonna di un nuovo foglio di calcolo e aggiungere le colonne Esperimento per il numero dell'esperimento e Trattamento per il trattamento sperimentale e qualsiasi altra variabile da analizzare.
Salvare questo file come caratteristiche. csv e aprire R Studio. Impostare la directory di lavoro su una cartella contenente la mfi.
csv e tratti. csv, evidenziare sezioni di codice e premere COMANDO INVIO per eseguire i comandi R come indicato nel file di comando commentato. I moduli di analisi della rete di correlazione ponderati significativamente correlati con ogni tratto sperimentale verranno esati come file grafico e la correlazione di ogni interazione con ogni modulo verrà eseguito come file CSV.
Per ogni interazione nel file di output ANC, identificare se tale interazione è significativa anche da CNA e creare una nuova colonna che indichi se ogni hit ANC è anche un hit CNA. Convertire i valori in modo da registrare la modifica a due pieghe e calcolare il valore medio per tutti gli hit CNA di unione ANC. Infine, crea un nuovo foglio di calcolo con ogni colpo CNA di unione ANC elencato dal suo obiettivo di immunoprecipitazione in una colonna, il suo obiettivo di sonda nella seconda colonna e il suo valore di modifica della piegatura nella terza colonna.
Importare questo file in Cytoscape come rete per creare un diagramma perimetrale del nodo. Le interazioni proteiche ad alta confidenza identificate dai due approcci statistici indipendenti sono visualizzate come diagrammi dei bordi dei nodi usando il software open source Cytoscape, o come mappe di calore usando il codice R e le istruzioni di analisi incluse nel materiale supplementare. In tutto il protocollo, gli utenti devono fare attenzione a pipettare con precisione, a tenere registri meticolosi e a mantenere i campioni freddi in ogni momento.
Abbiamo usato QMI per capire come le vie di trasduzione del segnale distinguono tra i diversi tipi di input e integrano le informazioni da più recettori.
