Questo protocollo ha un alto impatto nel campo della scoperta e dello sviluppo di farmaci, specialmente nello sviluppo di nuovi farmaci di prima classe con effetti collaterali minimi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi sistema GPCR e utilizzata per ottenere informazioni accurate sulla farmacologia dei recettori nei sistemi viventi in tempo reale. Le implicazioni di questa tecnica sono strettamente correlate alle nuove terapie, in particolare laddove le beta-arrestins sono rilevanti.
Questi includono recettori oppioidi nel dolore e recettori della dopamina nella schizofrenia. Questo metodo può essere utile in molte aree di ricerca scientifica medica dalla neurologia alla malattia cardiopolmonare. La dimostrazione PCR del nostro metodo è importante, perché consente una presentazione dettagliata dei passaggi critici del protocollo, che non sarebbe possibile con la pubblicazione convenzionale.
Inizia progettando primer per introdurre geni di interesse per i vettori pBiT. A causa del codone di arresto inframe che divide il sito di clonazione multipla, selezionare almeno uno dei tre siti come uno dei due enzimi di restrizione unici necessari per la clonazione direzionale. Fare riferimento al manoscritto per le sequenze nucleotidiche per codificare i residui del linker e incorporarli nei primer.
Per pBiT1.1-C e pBiT2.1-C assicurarsi che il primer in avanti contenga un codone ATG e una potente sequenza di consenso di Kozak. Per pBiT1.1-N e pBiT2.1-N assicurarsi che il primer inverso contenga un codone di arresto. Utilizzare i primer progettati per amplificare il DNA inserto del gene di interesse.
Combina i reagenti PCR secondo le indicazioni manoscritte, assicurandoti di utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni. Programmare il termociclo e avviare la reazione. Dopo aver completato la PCR, digerire il prodotto in una reazione di digestione di 50 microliter.
In un tubo da 1,5 millilitri, combinare 12 microlitri di acqua distillata, cinque microlitri dell'appropriato tampone di digestione di restrizione 10X e 30 microlitri del prodotto PCR. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di ogni enzima di restrizione. Vortice la miscela di reazione.
E incubare durante la notte a 37,5 gradi Celsius. Preparare una seconda reazione per digerire il plasmide ricevente. In un tubo da 1,5 millilitri, unire 23 microlitri di acqua, cinque microlitri dell'appropriato tampone di digestione di restrizione 10X, 15 microlitri del plasmide ricevente e 1,5 microlitri di ciascun enzima di restrizione.
Mescolare brevemente il tubo. E incubare durante la notte a 37,5 gradi Celsius. Il giorno successivo alla clonazione e alla trasformazione, scegli da tre a 10 singole colonie batteriche e trasferiscili in un millilitro di mezzo LB con ampicillina.
Incubare le cellule per sei ore. E poi trasferire 200 microlitri di sospensione batterica a cinque millilitri di mezzo LB fresco con ampicillina. Incubare la coltura a 37,5 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min durante la notte.
Il giorno successivo, isolare il plasmide con un kit di purificazione del DNA mini-preparazione. Scherma il plasmide purificato per una legatura di successo con PCR. Un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule su una piastra di poli-L-lisina rivestita di 96 pozzetti utilizzando il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 unità per millilitro di penicillina G e 100 microlitri per millilitro di streptomicina.
Aggiungere solo celle ai 60 pozzi interni per ridurre al minimo il potenziale di gradienti termici attraverso la piastra e gli effetti del bordo dall'evaporazione. Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sterile ai 36 pozzi esterni e 150 microlitri negli spazi tra i pozzi. Quindi incubare la piastra durante la notte a 37,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, eseguire la trasfezione utilizzando un totale di 100 nanogrammi di DNA. Impostare quattro diverse combinazioni di plasmidi in base alle direzioni del manoscritto. Utilizzando 20 microlitri del supporto essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES e 0,3 microlitri di reagente di trasfezione lipidica per pozzo.
Aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione lipidica e miscela di DNA ad ogni pozzo e mescolare la piastra in cerchi per 10 secondi. Incubare la piastra a 37,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore. Aggiornare il supporto.
E incubare per altre 24 ore. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo e aggiungere 100 microlitri del mezzo essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES ad ogni pozzo. Lasciare stabilizzare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti.
Nel frattempo, preparare il substrato di furimazina combinando un volume del substrato 100X con 19 volumi di tampone di diluizione LCS, creando uno stock 5X da mescolare con il mezzo di coltura cellulare. Quando le celle sono pronte, aggiungere 25 microlitri del calcio a ciascun pozzo e mescolare delicatamente la piastra per 10 secondi. Quindi misurare la luminescenza per 10 minuti a temperatura ambiente per la stabilizzazione del segnale.
Per gli esperimenti con l'aggiunta di ligandi, preparare la soluzione di ligando 13,5X nel supporto essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES e aggiungere 10 microlitri per pozzo utilizzando una pipetta multicanale. Quindi mescolare la piastra a mano o con uno shaker orbitale. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare le interazioni tra un GPCR prototipo e due isoforme beta-arrestin.
Sono state schermate quattro diverse combinazioni di plasmidi e quella con il segnale luminescente più alto è stata selezionata per ulteriori esperimenti. I valori EC50 per ogni isoforma beta-arrestina sono stati determinati utilizzando curve dose-risposta, ottenute dalla risposta massima di ciascuna concentrazione da studi cinetici. È fondamentale prestare particolare attenzione durante la progettazione dei primer PCR.
Lo sviluppo dei giusti costrutti è essenziale per il successo di questi saggi. Seguendo questa metodologia, sarai in grado di monitorare le interazioni recettore-beta-arrestina, nonché le interazioni del recettore con altre proteine citosoliche. Questa metodologia aiuterà a rispondere a domande fondamentali nel campo della farmacologia GPCR studiando come le interazioni GPCR-beta-arrestin possono essere modulate da modifiche nella struttura del ligando.
