I metodi qui presentati consentono la quantificazione delle lesioni del DNA indotte dallo stress ossidativo, contribuendo alla comprensione dei meccanismi fisiopatologici che possono essere bersaglio della prevenzione e del trattamento delle malattie. Selettività e sensibilità sono i principali vantaggi. La selettività è un vantaggio essenziale quando si lavora con campioni biologici complessi.
L'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem si è evoluto come gold standard per questo tipo di quantificazione con matrici biologiche. Lo stress ossidativo è un evento comune a diversi processi fisiopatologici. Sono stati rilevati livelli aumentati di addotti di eteno nei tessuti o nelle urine di pazienti con malattie infiammatorie.
Le lesioni del DNA forniscono anche informazioni su eventi endogeni innescati dall'esposizione agli inquinanti. Se le lesioni del DNA aumentano, l'esposizione può essere al livello che aumenta il rischio di sviluppo del cancro, ad esempio. Le lesioni possono essere quantificate nel DNA da qualsiasi sistema cellulare e in alternativa nelle urine, plasma, mezzo di coltura della saliva con adattamenti nella preparazione del campione.
Per iniziare, usa una piastra di coltura posta sul ghiaccio come base per tagliare un pezzo di tessuto con un bisturi. Pesare un grammo del tessuto in ogni tubo chiuso da 50 millilitri per un uso immediato. Conservare il tessuto rimanente sul ghiaccio secco prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
Ad ogni tubo, aggiungere 10 millilitri della soluzione di lisi cellulare commerciale contenente 0,5-millimolare deferoxamina e tenere sul ghiaccio. Impostare l'omogeneizzatore tissutale a bassa velocità, intorno ai 60-90 giri/min. Omogeneizzare i tessuti sul ghiaccio per alcuni minuti fino a quando la soluzione non è priva di frammenti di tessuto.
Quindi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di proteinasi K ad ogni campione omogeneizzato. Agitare i tubi per inversione e tenerli a temperatura ambiente durante la notte. Al mattino, aggiungere 40 microlitri di ribonucleasi Una soluzione, agitare per inversione e mantenere i tubi a temperatura ambiente per due ore.
Aggiungere cinque millilitri di soluzione commerciale di precipitazione proteica, vortice vigorosamente e centrifuga a 2.000 volte g, quattro gradi Celsius, per 10 minuti. Trasferire i supernaganti in tubi con limitato da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di isopropanolo freddo. Invertire delicatamente i tubi più volte fino all'osservazione del DNA precipitato.
Usa una pipetta Pasteur chiusa alla fine per raccogliere il DNA precipitato. Trasferire il DNA raccolto in tubi contenenti quattro millilitri di tampone Tris da 10 millimolare e deferoxamina millimolare a pH sette da sciogliere. Dopo che il DNA è stato completamente sciolto nei tubi, aggiungere quattro millilitri di una soluzione cloroformio contenente il 4% di alcol isoammil a ciascun tubo.
Invertire i tubi 10 volte per l'omogeneizzazione, centrifugare a 2.000 volte g, quattro gradi Celsius, per 10 minuti, e trasferire le fasi superiori a nuovi tubi. Ripetere il lavaggio della fase superiore con la soluzione cloroformio altre due volte. Quindi, aggiungere otto millilitri di etanolo assoluto e 0,4 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio a cinque molari per far precipitare il DNA.
Ancora una volta, raccogliere il DNA precipitato e trasferirlo in tre millilitri di 70% di etanolo. Ripetere il lavaggio con il 70% di etanolo ancora una volta. Scartare la soluzione di etanolo con cautela e invertire i tubi contenenti il DNA precipitato su carta assorbente per rimuovere la soluzione in eccesso.
Dopo aver preparato campioni di idrolisi del DNA con standard isotopico 15N5 di 1, N6-eteno-deossiadenosina e standard isotopico 15N5 di 1, N2-eteno-deossiguanosina secondo il manoscritto, trasferire 10 microlitri di ciascun campione in tubi per la quantificazione dei normali deossinucleosides da HPLC-UV. Sottosezione del volume residuo all'estrazione in fase solida. Per eseguire HPLC, elute prima una colonna C18 collegata a una cartuccia C18 SecurityGuard con una pendenza dello 0,1% di acido formico e metanolo.
Impostare il programma di gradiente da zero a 25 minuti con zero al 18%metanolo, da 25 a 27 minuti con 18-0%metanolo, quindi da 27 a 37 minuti con 0%metanolo a una portata di un millilitro al minuto e 30 gradi Celsius. Successivamente, iniettare un volume compreso tra due e sei microlitri per ciascun campione riservato alla quantificazione normale dei deossinucleosides. Impostare il rivelatore DAD a 260 nanometri per l'integrazione dei picchi di deossiguanosina e deossiadenosina.
Per eseguire l'estrazione in fase solida per analisi di 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina, caricare prima le cartucce con una serie di soluzioni ad un volume di un millilitro. Aggiungere 100% metanolo, acqua deionizzata, campione di DNA idrolizzato, acqua deionizzata, 10%metanolo, 15% metanolo e infine 100%metanolo per la raccolta. Quindi, procedere secondo il manoscritto.
Dopo aver preparato campioni di idrolisi del DNA 15N5 standard isotopico di 8-osso-deossiguanosina, trasferire 80 microlitri di ciascun campione in fiale per l'analisi nel sistema HPLC-ESI-MS/MS. Riservare i restanti 20 microlitri per la quantificazione della deossiguanosina su HPLC-UV, come fatto in precedenza. Per l'analisi dell'8-osso-deossiguanosina su HPLC-ESI-MS/MS, elutare la colonna C18 A accoppiata a una cartuccia SecurityGuard C18 con un gradiente di solvente A e B ad una portata di 150 microlitri al minuto e 25 gradi Celsius.
Eseguire la pompa binaria con zero-15% del solvente B durante i primi 25 minuti, dal 15 all'80% del solvente B da 25 a 28 minuti, dall'80% del solvente B da 28 a 31 minuti, dall'80 allo 0% del solvente B da 31 a 33 minuti e dallo 0% del solvente B da 33 a 46 minuti. Dirigere i primi 16 minuti della colonna A eluente allo spreco. Condizione colonna B dalla pompa isocratica con una soluzione di 15%metanolo in acqua contenente lo 0,1% di acido formico ad una portata di 150 microlitri al minuto.
Dopo sei minuti, controllare il cromatogramma per assicurarsi che la norma 8-osso-deossiguanosina eluisca dalla colonna A.Durante l'intervallo da 16 a 32 minuti, passare la valvola nella posizione che consente il collegamento tra la colonna A e la colonna B.Chiudere la valvola a 32 minuti per eludere l'8-osso-deossiguanosina dalla seconda colonna e ottenere un forte picco cromatografico. Per l'analisi di 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina, elutare una colonna C18 accoppiata a una cartuccia C18 SecurityGuard con un gradiente di solvente A e B ad una portata di 130 microlitri al minuto e 25 gradi Celsius. Eseguire la pompa binaria con lo 0% del solvente B per i primi 10 minuti, da zero al 20% del solvente B per 10-39 minuti, dal 20 al 75% del solvente B da 39 a 41 minuti, 75% del solvente B da 41 a 46 minuti, dal 75 allo 0% del solvente B da 46 a 47 minuti e 0% del solvente B da 47 a 60 minuti.
Utilizzare la valvola di commutazione per dirigere i primi 35 minuti di eluente agli sprechi e la frazione da 35 a 42 minuti alla fonte ESI. Assicurarsi che gli standard dell'addotto elute dalla colonna nell'intervallo impostato. Integrare i picchi dello standard isotopico 8-osso-deossiguanosina 15N5 di 8-osso-deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina, standard isotopico 15N5 di 1, N6-eteno-deossiadenosina, 1, N2-eteno-deossiguanosina e standard isotopico 15N5 di 1, N2-etheno-deossiguanosina dalle analisi HPLC-ESI-MS/MS.
Calcolare i rapporti di area per le curve di calibrazione e i campioni. Stabilire le curve di calibrazione e calcolare le quantità di lesioni in ogni campione iniettato. Integrare i picchi di deossiguanosina e deossiadenosina dalle analisi HPLC-UV.
Utilizzare le aree per stabilire le curve di taratura e calcolare le quantità di deossiguanosina e deossiadenosina negli animali in ogni campione iniettato. Calcolare le frazioni molare per 8-osso-deossiguanosina sulla deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina sulla deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina sulla deossiguanosina, che danno il numero di lesioni per un milione di deossiguanosina normale o deossiadenosina. Un cromatogramma rappresentativo del DNA purificato ottenuto dall'HPLC-UV mostra la presenza dei quattro normali deossinucleosides, liberi dai ribonucleosides dell'RNA, dimostrando la purezza del DNA.
Sono mostrati cromatogrammi rappresentativi dell'HPLC-ESI-MS/MS di 8-osso-deossiguanosina, 1, N6-eteno-deossiadenosina e 1, N2-eteno-deossiguanosina nei campioni di DNA dei tessuti topi. Il cromatogramma ottenuto con il rilevamento UV mostra i quattro normali deossinucleosides che eluivano dalla prima colonna fino a circa 10 minuti, con una buona separazione dall'8-osso-deossiguanosina, eliminando le interferenze indesiderate. Una cosa importante da ricordare per la quantificazione esatta è avere sempre le stesse quantità di standard interni nel volume di iniezione nelle curve di calibrazione e nei campioni.
I metodi qui presentati possono essere adattati per la quantificazione di altri deossinucleosides modificati. L'espansione della banda di deossinucleosides modificati consente una migliore comprensione dei meccanismi fisiopatologici sottostanti. Possiamo indagare il ruolo del danno ossidativo in diverse situazioni come l'esposizione a xenobiotici, diabete e trasformazione maligna cellulare, favorendo così lo sviluppo di strategie preventive e terapeutiche.
