I metodi ottici, come l'optogenetica, possono fornire la modulazione precisa dei segnali molecolari cellulari. Il nostro protocollo ha dimostrato una manipolazione ottica orale delle molecolari del segnale cellulare mediante stimolazione laser al femtosecondo. Accoppiando il nostro laser a femtosecondi in un microscopio confocale, la nostra tecnica può fornire un funzionamento a livello monocellulare o subcellulare mediante stimolazione laser femtosecondo e il monitoraggio dinamico molecolare in tempo reale mediante microscopia confocale.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema di microscopia fluorescente accoppiando un laser a femtosecondi nel sistema nel modo corretto. Per chiunque stia provando il nostro metodo per la prima volta, si prega di seguire le istruzioni separate della struttura laser o cercare indicazioni da professionisti quando si utilizza una sorgente laser femtosecondo di laboratorio. Per iniziare, accendi il laser femtosecondo e il microscopio confocale.
Utilizzare specchi riflettenti per dirigere il raggio laser del femtosecondo attraverso un otturatore meccanico. Successivamente, impostare un telescopio a relè composto da un paio di lenti per espandere la larghezza del fascio di trasmissione. Ciò dovrebbe essere coerente con l'apertura posteriore dell'obiettivo.
Ora, guida gli specchi riflettenti per allineare il fascio espanso al microscopio. Regolare i due specchi riflettenti, qui sottolineati, per sintonizzare la messa a fuoco del laser femtosecondo al centro del campo visivo. Infine, misurare e sintonizzare i laser come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.
Coltura Cellule di Hela usando tecniche standard. Quando è pronto per eseguire l'esperimento, trasfetto le celle con ERK2-GFP come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, accendi il microscopio confocale a scansione laser e il laser a femtosecondi.
Assicurarsi che l'otturatore del laser sia chiuso. Quindi, aprire il software del microscopio. Impostare il laser di eccitazione a 488 nanometri e impostare il suo livello di potenza a 0,1 milliwatt.
Impostare la dimensione dell'imaging su 512 per 512 pixel e il tempo di intervallo di ogni pixel come 2,4 microsecondi. Quindi, imposta il tempo di intervallo tra due fotogrammi a sei secondi per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto e i danni fotografici alle cellule. Inoltre, impostare i fotogrammi di imaging totali a circa 300 fotogrammi per fornire circa 30 minuti di microscopia continua in un singolo esperimento.
Prendi il piatto contenente le cellule Hela trasfetate con ERK2-GFP dall'incubatrice e metti il piatto sul palco del microscopio. Nel software, avviare la modalità di scansione rapida e ottimizzare l'obiettivo di acquisire immagini fluorescenti chiare delle celle. Quindi, interrompere la scansione rapida e passare alla modalità di imaging a campo luminoso utilizzando la fotocamera CCD.
Aprire l'otturatore e regolare la distanza tra le due lenti del telescopio a relè per assicurarsi che il diametro della messa a fuoco laser del femtosecondo sia di circa due micron. Quindi, chiudere l'otturatore per completare la regolazione. Impostare la potenza del laser a femtosecondi a 15-40 milliwatt per un laser da 810 nanometri, o da 20 a 60 milliwatt per un laser da 1040 nanometri.
Quindi, impostare l'orario di apertura dell'otturatore da 05 a 0,2 secondi. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare una cella di destinazione che esprime fortemente ERK2-GFP. Una volta trovato, spostare lo stadio per localizzare l'area del citosolo della cella di destinazione selezionata in modo che si trova al centro del campo visivo quando si è sotto l'imaging a campo luminoso.
Una volta centrato, fai clic sul pulsante start per iniziare l'imaging continuo. Aprire l'otturatore in qualsiasi fascia oraria predefinita per fornire la stimolazione laser al femtosecondo nella cella di destinazione. Al termine del processo di imaging, salvare i dati di imaging per ulteriori analisi.
Impostare la potenza del laser femtosecondo a 15-40 milliwatt e 810 nanometri e da 20 a 60 milliwatt e 1040 nanometri al campione. Quindi, prendere il piatto contenente cellule trasfette con ERK2-GFP dall'incubatrice e metterlo sul palco del microscopio. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare la cella di destinazione che esprime bene ERK2-GFP.
Quindi, impostare il processo di imaging confocale e definire uno speciale fotogramma di scansione come fotogramma di stimolazione nel processo di imaging. Definire il parametro del fotogramma di stimolazione. Impostare una regione di scansione di due per due o tre per tre micron quadrati nell'area del citosolo vicino al nucleo nella cellula bersaglio.
Impostare il tempo totale di scansione su 0,1 a 0,2 secondi. Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi a sei secondi e impostare i fotogrammi di imaging totali su circa 300 fotogrammi per fornire circa 30 minuti di microscopia continua. Salvare i dati di imaging per ulteriori analisi dei dati.
Sincronizzare l'otturatore del laser femtosecondo con quello della scansione confocale in base all'area di stimolazione fotografica predefinita che è aperta solo quando la scansione laser scende nel fotogramma di stimolazione. Fare clic sul pulsante start per avviare il processo di imaging continuo della microscopia. Per osservare la dinamica morfologica mitocondriale, trasfetto le cellule di Hela con Mito-GFP per indicare fluorescentmente i mitocondri, o una base con mito-cpYFP per osservare i mitoflash.
Dopo la trasfezione, accendere il laser a femtosecondi e assicurarsi che l'otturatore sia chiuso. Quindi, accendere il microscopio confocale a scansione laser. Impostare il laser di eccitazione a 488 nanometri.
Quindi, impostare il livello di potenza del laser da 488 nanometri a 0,1 milliwatt. Inoltre, impostate le dimensioni dell'imaging su 512 per 512 pixel e il tempo totale di imaging di ogni fotogramma su 2,2 secondi. Quindi, impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi a zero secondi e i fotogrammi di imaging totali come 200 fotogrammi per fornire circa 440 secondi di microscopia continua in un singolo esperimento.
Prendere il piatto contenente cellule trasfette con mito GFP o proteina fluorescente gialla permutata in modo circolare mirata in modo mitocondriale dall'incubatrice e mettere il piatto sullo stadio del microscopio. Controllare lo stato del laser femtosecondo per assicurarsi che la messa a fuoco del laser a femtosecondi si trovi al centro del campo visivo. Quindi, impostare una freccia di riferimento al centro della finestra di imaging fluorescente per indicare la posizione dello stato attivo.
Successivamente, impostare la potenza del laser al femtosecondo a cinque-30 miliwatt con il laser a 810 nanometri e da 10 a 40 milliwatt per il laser a 1040 nanometri. Impostare l'orario di apertura dell'otturatore su 05 a 0,1 secondi. Utilizzare la modalità di scansione rapida per selezionare la cellula bersaglio che esprime bene mito GFP o la proteina fluorescente gialla permutata circolare mirata ai mitocondriali.
Selezionate un mitocondrio casualmente nella cellula bersaglio come soggetto sperimentale. Quindi, spostare lo stadio del microscopio per localizzare la struttura tubolare mitocondriale target al centro del campo visivo in modalità di scansione rapida come indicato dalla freccia di riferimento. Fare clic sul pulsante start per avviare l'imaging continuo.
Infine, aprire l'otturatore in qualsiasi momento predefinito per fornire la stimolazione laser al femtosecondo nella struttura tubolare mitocondriale bersaglio. Attendere il completamento del processo di imaging, quindi salvare i dati di imaging per ulteriori analisi dei dati. Utilizzando il metodo presentato in questo protocollo, ERK2 si trasferisce nel nucleo dopo essere stato trattato con un breve lampo del laser a femtosecondi.
La fluorescenza ERK2-GFP raggiunge il massimo dopo diversi minuti di stimolazione laser al femtosecondo. Le molecole ERK2 saranno defosforilate dopo aver attivato substrati a valle nel nucleo e quindi l'ERK2 tornerà al citoplasma indicato da una diminuzione della fluorescenza nucleare della GFP. ERK2 può essere attivato più volte da più stimolazioni fotografiche.
Pertanto, è possibile manipolare il modello di segnale ERK2 con precisione controllando il tempo di intervallo tra più stimoli. Inoltre, L'ERK2 può occasionalmente essere attivato in celle adiacenti intorno alla cellula stimolata. Questa osservazione indica che alcune molecole diffusibili possono essere rilasciate dalla cellula trattata con il laser femtosecondo per attivare ERK2 nelle cellule adiacenti.
La fosforilazione della proteina a valle ERK2 eIF4E può essere confermata individualizzata mediante microscopia ad immunofluorescenza. Questo risultato indica che la stimolazione laser al femtosecondo può attivare con successo la via di segnalazione ERK. I flash ossidativi mitocondriali o miflash sono esplosioni ossidativi nei mitocondri che si radicolano da dinamiche molecolari complesse.
L'implementazione di questo schema di stimolazione fotografica ha portato a un'eccitazione mitoflash di successo. Questa stimolazione fotografica mostra anche varietà di dinamica molecolare mitocondriale tra cui la frammentazione e il ripristino della morfologia mitocondriale, nonché l'oscillazione del potenziale della membrana mitocondriale. Simili ai mitoflash attivati dalla foto, questi eventi di mitocondri hanno prestazioni diverse con diverse intensità di potenza.
La cosa più importante è assicurarsi che la messa a fuoco, le dimensioni e la precisione del laser al femtosecondo siano una proprietà per la stimolazione nelle cellule. Il laser femtosecondo vicino all'infrarosso può essere pericoloso per gli utenti. Quando si segue questo protocollo, indossare una protezione adeguata e impedisce al laser di diffondersi dal tavolo ottico.
