Gli autori vorrebbero riconoscere NanoVentures Australia per sostegno finanziario di viaggio e il Prof. John Haycock per aver ospitato in parte questa ricerca presso l&#39;Università di Sheffield e la signora Jaimee Mayne per il suo aiuto durante le riprese.

1. Au NR Preparazione Nota: Au NR può essere sintetizzato da un numero di ricette 16, o acquistati da fornitori commerciali. <ol><li> Misurare la densità ottica iniziale (OD) della soluzione Au NR tramite spettroscopia UV-Vis, registrando i valori di assorbimento da 300 nm a 1000 nm con una risoluzione di 0,5-2 nm. Variare il volume della soluzione da usare con la cuvetta disponibili. </li><li> Valutare la concentrazione iniziale NP molare con una tecnica 17 Ideale (ad esempio la spettroscopia UV-Vis, singola particella ICP-MS, microscopia elettronica a trasmissione) o utilizzare i valori di concentrazione forniti dal venditore. </li><li> Preparare una soluzione madre 5 ml diluendo il campione iniziale Au NR raggiungere un OD = 1. Per una migliore ripetibilità, mantenere costante OD per tutti i campioni testati. Seguire protocollo del fornitore commerciale per la composizione del solvente di diluizione. Se non sei sicuro, Usare acqua deionizzata. </li><li> Centrifugare 1 ml della soluzione Au NR due volte per 15 minuti a 7800 xg per rimuovere qualsiasi eccesso chimico dalla soluzione. Cicli di centrifugazione può variare in vigore e nel tempo (ad esempio, 20 min a 5.600 × g) 18. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le NRs in acqua deionizzata. Come particelle risospeso potrebbero formare aggregati in soluzione, prepararli giorno per avere i migliori risultati. In alternativa, conservare in frigorifero per non più di 1 settimana. Non congelare. </li><li> Prima di utilizzare in condizioni di coltura cellulare, sonicare la soluzione Au NR per 5 minuti e poi sterilizzare con la luce UV per 30 minuti (intensità di radiazione UV non meno di 400 mW ∙ m -2 a 254 nm). </li></ol> 2. NG108-15 cellule neuronali Linea Cultura e differenziazione <ol><li> Per mezzo di coltura cellulare, preparare 500 ml di mezzo sterile modificato di Dulbecco Eagle (DMEM) contenente 10% (w / v) di siero fetale bovino (FCS), 1% (w / v) L-glutammina, 1%(W / v) di penicillina / streptomicina e 0,5% (w / v) anfotericina B. Nota: Gli integratori possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C e aggiunti ai media il giorno desiderato. Mezzo di coltura cellulare può essere refrigerato in condizioni sterili per un massimo di 1 mese. </li><li> Per il mezzo differenziazione cellulare, preparare 50 ml di DMEM sterile contenente 1% (w / v) L-glutammina, 1% (w / v) di penicillina / streptomicina e 0,5% (w / v) anfotericina B. </li><li> Grow NG108-15 cellule neuronali in 10 ml di mezzo di coltura cellulare in fiasche T75 in polistirolo in un incubatore con un&#39;atmosfera umidificata (5% CO 2 a 37 ° C). Normalmente, sementi 1,5-2 x 10 5 cellule in ogni contenitore per essere pronto in 3-4 giorni. Cambiare mezzo di coltura cellulare ogni due giorni. Nota: per evitare derive genetiche o di variazione, non usare le cellule di età superiore a 21 passaggio per gli esperimenti. </li><li> Quando 70-80% confluenti nella cultura, cambia il mezzo con mezzo di caldo coltura cellulare fresca. Meccanicamente staccare le cellule delicatamente Knocre il fondo del pallone confluenti. Non usare tripsina. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 600 xg e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di mezzo caldo differenziazione cellulare. </li><li> Seed 2 × 10 4 cellule / cm 2 in una piastra di coltura tissutale polistirene ben 96 con 200 ml di terreno di differenziamento cellulare. Incubare l&#39;esperimento per 1 giorno al 5% di CO 2/37 ° C. </li><li> Aggiungi tra 3,2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 particelle / ml di soluzione Au NR il giorno 2 ed incubare per ulteriori 24 ore. Non aggiungere le particelle per gli esperimenti di controllo. Nota: Come controllo alternativo, Au NP con un picco d&#39;onda di assorbimento ben differenziati possono essere utilizzati ai fini del confronto 14. Per un comportamento cellulare più coerente, mantenere la densità costante di cella e non modificare la superficie ben prima della semina delle cellule. </li></ol> 3. crescita dei neuriti Enhancement <ol><li> Coppiail laser con una fibra ottica monomodale (apertura numerica = 0.13) e terminare con un connettore in fibra (connettori FC sono convenienti e comunemente disponibili). Misurare la potenza del laser di uscita con un misuratore di potenza standard. Per ottenere risultati ottimali, abbinare il picco di lunghezza d&#39;onda del laser al picco di risonanza plasmonica di NR. </li><li> Il giorno 3 dopo incubazione NR, fissare il connettore FC al pozzo. Irradiare campioni ed i controlli a temperatura ambiente per 1 minuto in onda continua, per le diverse potenze laser. Lasciare che la cultura di procedere per 3 giorni aggiuntivi in 5% CO 2/37 ° C. Ripetere la radiazione laser per un minimo di 3 misurazioni indipendenti. Nota: differenti tempi di irradiazione e possono essere selezionati frequenze impulsi, a seconda dell&#39;applicazione. </li><li> Caratterizzano il laser in termini di diametro del raggio e di irraggiamento laser (W ∙ cm -2). <ol><li> Per una singola fibra modalità standard, utilizzare NA = n ∙ sin θ,dove n è l&#39;indice di rifrazione del mezzo in uso e θ è la metà-angolo del cono di luce uscenti dalla fibra (vedere Figura 1A). Da trigonometria, r = tan θ ∙ d, dove r è il raggio del fascio e d è la distanza tra la fibra e il campione. Il connettore FC corrisponde al diametro del pozzo, quindi illuminando il campione ad una distanza d = 2,70 ± 0,20 mm. Luce esce la fibra in acqua (n = 1.33), dando r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d. </li><li> Utilizzando quest&#39;ultima equazione, calcolare il raggio del fascio laser, l&#39;area corrispondente trave e l&#39;irradianza media del laser (potenza del laser divisa per l&#39;area del fascio) sul bersaglio (si veda il grafico esempio nella Figura 1B). Questi valori rappresentano l&#39;irraggiamento medio sopra l&#39;area illuminata. </li><li> Valutare gli errori per le misure con la teoria generale di propagazione degli errori. Nota: La distanza bra il connettore FC e il campione possono essere misurati con fotografie del dispositivo sperimentale e post-elaborazione delle immagini utilizzando il software appropriato (per esempio ImageJ). </li></ol></li><li> Al giorno 5, rimuovere terreno di differenziamento cellulare dagli esperimenti e fissare i campioni con 3,7% (v / v) di formaldeide per 10 minuti, poi permeabilize le cellule con 0,1% (v / v) Triton X-100 per 20 min. </li><li> Aggiungere 3% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) per i campioni per 60 min per bloccare siti di legame della proteina non reagito. Etichettare i campioni per il pernottamento anti-βIII-tubulina (5 mg / ml in PBS integrato con 1% di BSA) a 4 ° C. </li><li> Incubare le cellule per 90 minuti al buio con un anticorpo secondario appropriato (topo anti-anticorpo es TRITC-coniugato IgG) utilizzando una concentrazione di 0,4-2 mg / ml in 1% BSA in PBS. Etichettare i nuclei delle cellule con DAPI (0,1 mg / ml in acqua deionizzata) per 10 minuti. Nota: coniugazione di anticorpi e concentrazione migHT variano secondo il protocollo aziendale. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 minuti dopo ogni fase di colorazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li> Campioni Immagine di epifluorescenza o microscopia confocale utilizzando almeno un 20 × obiettivo. Scegli il microscopio filtri di conseguenza per l&#39;anticorpo secondario. Selezionare un filtro DAPI (λ = 358 nm EX; λ = EM 488 nm) per visualizzare i nuclei delle cellule. </li><li> Analizzare le immagini valutando: i) la lunghezza massima dei neuriti (registrare la lunghezza dalla punta del neurite all&#39;inizio del corpo cellulare), ii) il numero di neuriti per cellula neuronale (riassumere tutti i neuriti per cella) e iii) la percentuale di cellule con neuriti (dividere il numero totale di cellule che esprimono βIII-tubulina per il numero totale di cellule con un nucleo tinto positivamente) 19. </li></ol> 4. laser-indotta intracellulare Ca 2+ Imaging <ol&gt; <li> Preparare un 20% (w / v) di soluzione stock di Pluronic F-127 sciogliendo 2 g di soluto in 10 ml di dimetilsolfossido anidro (DMSO). Riscaldare la soluzione di Pluronic F-127 a 40 ° C per circa 20 minuti per aumentare la solubilità. Preparare in anticipo se conservato a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno 3 dopo NR incubazione, preparare una soluzione salina bilanciata (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, CaCl 1,5 mm 2, MgCl 0,5 mm 2, 5.6 mM glucosio, e HEPES 10 mM, pH 7.4) e integrato con 5 pM di Fluo-4 sono nella DMSO e 0,1% (w / v) di soluzione Pluronic F-127. Nota: soluzione BSS può essere preparata in anticipo e refrigerato per un massimo di 1 mese. Aggiungere i supplementi (Fluo-4 AM ed Pluronic F-127), il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Rimuovere terreno di differenziamento cellulare e sostituirlo con la soluzione BSS integrata. Per ottenere i migliori risultati con un microscopio confocale invertito, incubare le cellule in un micro-pozzetto. </li><li> Carica NG108-15 cellule con Fluo-04:00per 30 minuti al buio a 5% di CO 2/37 ° C. Dopo il tempo di incubazione, lavare campioni due volte con BSS per rimuovere eventuali fluoroforo scarico extracellulare. </li><li> Coppia il laser con una fibra ottica monomodale e fende la punta utilizzando tecniche standard. Osservare la punta risultante sotto un microscopio ottico, per assicurare una superficie di alta qualità (cioè la punta deve essere perpendicolare all&#39;asse della fibra e piatto su controllo microscopia). <ol><li> Misurare la potenza del laser di uscita con un misuratore di potenza standard. Inserire la fibra di consegna luce in un supporto in fibra ottica e applicarla ad un micropositioner. Fare riferimento a Brown et al. 20 per maggiori dettagli sulla preparazione fibra ottica e il posizionamento. Attenzione: Seguire le regole generali per la sicurezza laser durante la misurazione della potenza del laser (per esempio non guardare direttamente il raggio laser, indossare occhiali di sicurezza laser durante la manipolazione, evitare l&#39;esposizione alla luce diffusa ad altri utenti del laboratorio) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li> Collegare un oscilloscopio per il laser portatile per monitorare la modulazione ottica. Utilizzare un segnale binario con frequenze variabili (0,5-2 Hz) e lunghezze di impulso (20-100 msec). Collegare il laser utilizzando il segnale di modulazione come logica transistor-transistor (TTL) ingresso per microscopio, in seguito alla configurazione mostrata in Paviolo et al. 13. <ol><li> Collocare le cellule con un microscopio confocale invertito e posizionare la fibra consegna luce 250 ± 50 micron dalla cellula bersaglio in modalità di trasmissione di illuminazione. A questa distanza, utilizzare le equazioni presentati in 3.3.1 per calcolare il raggio del fascio sul bersaglio. </li></ol></li><li> Utilizzare un laser ad argon-ion (488 nm) per eccitare l&#39;interiorizzato Fluo-04:00 dye (λ = 494 nm EX; λ PN = 516 nm) e la LD sincronizzato per l&#39;eccitazione delle NRs endocitosi. Eseguire la immagini a RT di campioni e controlli utilizzando almeno un obiettivo 40 × raccogliendo scansioni time-seriescon 256 × 256 pixel / risoluzione fotogramma in modalità di andata e ritorno con una frequenza di almeno 4 Hz. Eseguire una registrazione senza alcuna eccitazione LD per identificare qualsiasi interferenza laser argon-ion (rumore di fondo). </li><li> Rimuovere lo sfondo dei dati utilizzando adattivo ponderati penalizzati minimi quadrati algoritmi 21. Tracciare le indotte Ca 2+ variazioni in funzione del tempo. Analizzare i picchi transitori di intensità di fluorescenza utilizzando immagine software di post-elaborazione per soglia ad un livello tre volte la deviazione standard del rumore di fondo (3σ). </li></ol>

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The authors have no competing interests to disclose.

I protocolli descritti in questa presentazione descrivono come la cultura, differenziare e otticamente stimolare le cellule neuronali utilizzando assorbitori estrinseci. Le caratteristiche NR (ad esempio le dimensioni, la forma, risonanza plasmonica di lunghezza d&#39;onda e chimica di superficie) ei parametri di stimolazione laser (come la lunghezza d&#39;onda, la lunghezza di impulso, frequenza di ripetizione, ecc) possono essere variate per soddisfare diverse esigenze sperimentali. Gli effetti sul comportamento delle cellule possono essere monitorati tramite saggi biologici standard e materiali. Nel complesso l&#39;approccio fornisce un semplice, ma potente, modo di irradiare popolazioni di cellule in vitro e potrebbe essere esteso a pile, di campioni di tessuto e studi in vivo. I principali requisiti che Au NR devono soddisfare per essere utilizzati per applicazioni biologiche sono la stabilità (sia chimica e fisica) e biocompatibilità. Quest&#39;ultima è particolarmente critica, a causa della presenza di un tensioattivo cationico (comunely CTAB) sulla superficie del Au. CTAB è noto per indurre citotossicità in vitro sia in vivo 28 e 29 ed è comunemente utilizzata durante il processo di sintesi per guidare la formazione NR-figura 30. Stabilità e biocompatibilità sono spesso migliorati depositando ulteriori rivestimenti sulla superficie Au NR (per esempio polietilenglicole, silice) 31. Per valutare la biocompatibilità, saggi differenti possono essere utilizzati in vitro (es vivo / morto, MTS, MTT, ecc) mentre l&#39;analisi istologica viene spesso eseguita durante gli esperimenti tessuto 7,8,12,15. Un&#39;altra sfida da affrontare quando si lavora con nanomateriali è la difficoltà di determinare correttamente la loro concentrazione molare. L&#39;enorme varietà di NP in termini di forma, dimensione, e le proprietà chimiche rende le tecniche attualmente disponibili adatto solo alcune classi di particelle. Ad esempio, la Scatt luce dinamica di serieMetodo rendo presuppone che NP hanno una forma sferica e dispersione della luce isotropa 17. Pertanto, l&#39;applicazione di questo metodo per risultati Au NRS in discrepanze tra la concentrazione misurata e quella reale. Il problema della concentrazione NP è particolarmente problematico se relative al campo nanomedicina, dove la concentrazione somministrata deve essere controllato con precisione al fine di massimizzare l&#39;efficacia del processo (ad esempio per applicazioni drug delivery) e minimizzare la tossicità dei nanomateriali 17. Negli studi riportati qui, la densità ottica utilizzata ha dato buoni risultati in termini di vitalità cellulare e numero di particelle. A causa delle loro proprietà di assorbimento intrinseche, Au NP sono spesso usati in combinazione con una sorgente laser. Durante l&#39;esposizione, l&#39;assorbimento e la dispersione sono i due principali processi che possono verificarsi sulla superficie delle nanoparticelle. Se la lunghezza d&#39;onda del laser corrisponde alla lunghezza d&#39;onda di risonanza plasmonica, assorbimento spessoprevale su dispersione, emozionanti gli elettroni di conduzione in superficie NP. Queste formano un gas di elettroni che si allontana dalla sua posizione di equilibrio e crea una oscillazione coerente risonanza chiamato la risonanza plasmonica superficiale localizzata (LSPR). L&#39;energia viene quindi trasferita al reticolo cristallino NP come calore, che viene successivamente dissipata rapidamente nell&#39;ambiente circostante 32. Poiché il calore è il principale effetto osservato dopo l&#39;eccitazione del NR LSPR, è opportuno monitorare la vitalità cellulare dopo l&#39;esposizione laser. E &#39;stato ipotizzato che gli effetti osservati sulla crescita dei neuriti e intracellulare Ca 2+ percorso erano dovuti al riscaldamento transitorio derivante dalla eccitazione del LSPR. Questa ipotesi è in linea con l&#39;attivazione del canale TRPV1 termosensibile dopo esposizione magnetico NP ferrite 5. Questo processo è anche coerente con le osservazioni che i canali TRPV4 termosensibili play un ruolo importante in infrarossi stimolazione nervosa 33. A livello molecolare, è stato recentemente dimostrato che TRPV4 è termosensibile solo dopo l&#39;interazione di phosphoinositide -4,5 -biphosphate (PIP 2) con il canale 34. Pertanto, è possibile che il riscaldamento transitorio insorto dopo NR eccitazione potrebbe servire per accelerare e / o indurre l&#39;apertura dei canali TRPV4. Questa ipotesi può essere confermata da future Ca 2+ esperimenti utilizzando Ca 2+ - media liberi e / o controlli molecolari sul PIP 2 esaurimento. Diversi gruppi hanno inoltre dimostrato che i piccoli gradienti di temperatura nella gamma di temperatura fisiologica possono essere utilizzati per indurre altre risposte, come cono di crescita neuronale guida 25 o depolarizzante correnti in cellule renali embrionali umane 35. Yong e collaboratori hanno registrato un significativo aumento dell&#39;attività segnale elettrico in primaria cult neuroni uditivirato con silice rivestite Au NRs dopo irradiazione laser dei NRs al LSPR. Il riscaldamento prodotto dalle particelle irradiate laser è stata misurata utilizzando tecniche di patch-clamp 14. Più recentemente, Eom et al. Registrato un aumento dell&#39;ampiezza di CNaPS dopo esposizione laser di 3,4 × 10 9 Au NR quando continuamente perfuso in prossimità della guaina del fascio nervoso di un ratto nervo sciatico 15. L&#39;effetto stimolante del diodo laser 780 nm osservato durante gli esperimenti non era legato a calore generato dall&#39;assorbimento di acqua, in quanto questo è noto per essere trascurabile a 780 nm 36. Risultati precedentemente pubblicati hanno riportato effetti stimolatori di 780 nm luce sul tessuto neuronale in vivo 37,38. Studi in vitro hanno dimostrato il coinvolgimento di specie reattive dell&#39;ossigeno nel processo 39. Tuttavia, i meccanismi dettagliati per il quale la stimolazione NIR colpisce gene transcription e altre attività cellulari sono attualmente irrisolti. Dati attuale suggerisce l&#39;interazione di effetti diversi nella stimolazione, tra l&#39;assorbimento di fotoni all&#39;interno cromofori nei mitocondri (quasi il 50% dell&#39;energia a 780 nm può essere assorbito dal citocromo c ossidasi) 37,39-41, cambiamenti nella permeabilità della membrana al calcio 37 e inibizione dell&#39;attività infiammatoria nelle cellule 37. I risultati presentati in questo manoscritto dimostrano che assorbitori di nanoparticelle molto promettenti per le applicazioni future in ottica stimolazione delle cellule neuronali. Il vantaggio principale risiede nella capacità di NIR luce di penetrare in profondità nei tessuti (finestra terapeutica). Questi risultati mostrano anche che assorbitori nanoparticelle possono migliorare e / o sostituire il processo di infrarossi stimolazione neurale basato su assorbimento di acqua. Per le applicazioni future in protesi neurali, sarebbe interessante indagare diversi functionalizat superficieioni con affinità chimica per assoni neuronali, che sono i principali obiettivi per molte applicazioni di stimolazione ottica.

Recenti studi hanno dimostrato che il riscaldamento transitoria associata con l&#39;assorbimento di luce infrarossa da acqua (lunghezza d&#39;onda&gt; 1.400 nm) può essere utilizzato per indurre potenziali di azione nel tessuto nervoso 1 e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti 2. L&#39;uso di luce infrarossa ha suscitato notevole interesse per applicazioni in protesi neurali, a causa della potenziale risoluzione spaziale più fine, di un contatto diretto con il tessuto, la minimizzazione degli artefatti di stimolazione, e la rimozione della necessità di modificare geneticamente le cellule prima della stimolazione ( come richiesto in optogenetics) 1. Nonostante tutti questi vantaggi, modelli termici recentemente sviluppati suggerito che i destinatari dei tessuti / cellule possono essere influenzati da effetti di riscaldamento cumulativi, quando più siti di stimolo e / o alti tassi di ripetizione sono utilizzati 3,4. In risposta a queste sfide, i ricercatori hanno riconosciuto il potenziale di utilizzare absor estrinsecabri per la stimolazione del nervo a produrre effetti di riscaldamento più localizzati nel tessuto. Huang et al. Ha dimostrato questo principio usando nanoparticelle di ferrite superparamagnetiche per attivare da remoto i canali TRPV1 sensibili alla temperatura in HEK 293 cellule con una radio-frequenza di campo magnetico 5. Sebbene questa tecnica può consentire una penetrazione più profonda (campi magnetici relativamente interagiscono debolmente con tessuto), le risposte sono state registrate solo su periodi di secondi, piuttosto che le durate di millisecondi richiesti dispositivi bionici 5. Allo stesso modo, Farah et al. Stimolazione elettrica dimostrato di neuroni corticali di ratto con neri micro particelle in vitro. Hanno mostrato di precisione a livello di cella nella stimolazione con durate di impulso dell&#39;ordine di centinaia di ms ed energie nella gamma di μJ, potenzialmente permette tassi di ripetizione più veloce 6. L&#39;uso di assorbitori estrinseci è stata applicata anche per indurrecambiamenti morfologici in vitro. Ciofani et al. Hanno evidenziato un aumento del ~ 40% nella crescita neuronale utilizzando piezoelettrici boro nitruro nanotubi eccitato da ultrasuoni 7. Analogamente, ferro endocitosi nanoparticelle di ossido in cellule PC12 sono stati riportati per migliorare la differenziazione dei neuriti in modo dose-dipendente, causa l&#39;attivazione di molecole di adesione delle cellule con l&#39;ossido di ferro 8. Recentemente, l&#39;interesse assorbitori estrinseci per assistere stimolazione neurale è anche concentrato sull&#39;uso di nanoparticelle di oro (Au NP). Au NP hanno la capacità di assorbire efficacemente luce laser al picco plasmonica e dissiparlo nell&#39;ambiente circostante nella forma di calore 9. Tra tutte le forme di particelle disponibili, l&#39;assorbimento ottico di nanotubi d&#39;oro (Au NR) corrisponde comodamente la finestra terapeutica di tessuti biologici (vicino infrarosso - NIR, lunghezza d&#39;onda tra 750-1,400 nm) 10. Inoltre, nel context di stimolazione neurale, l&#39;uso di Au NR offre biocompatibilità relativamente favorevole e una vasta gamma di opzioni di funzionalizzazione superficiale 11. Recenti studi hanno dimostrato che un effetto stimolante sulla differenziazione può essere indotta dopo esposizione laser continue di Au NR in NG108-15 cellule neuronali 12. Allo stesso modo, transienti intracellulari di calcio sono stati registrati in cellule neuronali coltivate con Au NRs dopo irradiazione laser modulato con frequenze variabili e lunghezze di impulso 13. Membrana cellulare depolarizzazione si è registrato anche dopo l&#39;illuminazione laser NIR di Au NRs in colture primarie di neuroni gangliari spirale 14. La prima applicazione in vivo con irradiato Au NR è stata dimostrata solo di recente. EOM e collaboratori esposti Au NRs al loro picco plasmonica e hanno registrato un aumento di sei volte in ampiezza dei potenziali d&#39;azione del nervo composto (CNaPS) e una diminuzione di tre volte nella soglia di stimolazione in ratti nervi sciatico. L&#39;enrisposta ampliate è stato attribuito a effetti di riscaldamento locali derivanti dalla eccitazione del NR picco plasmonica 15. Nel presente lavoro, vengono specificati protocolli per studiare gli effetti della stimolazione laser a NG108-15 cellule neuronali coltivate con Au NR. Questi metodi forniscono una semplice, ma potente, modo di irradiare popolazioni cellulari in vitro usando tecniche biologiche standard e materiali. Il protocollo si basa su un diodo laser accoppiato in fibra (LD) che permette un funzionamento sicuro e ripetibile allineamento. La preparazione del campione e laser metodi di irraggiamento Au NR possono essere ulteriormente estesi a diverse forme di particelle e colture cellulari neuronali, a condizione che si conoscono, rispettivamente, i protocolli di sintesi e di cultura specifica.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Varian Medical Systems Inc.</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Mini Spin</td><td></td></tr><tr><td>Sonic bath</td><td>Unisonics Australia</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Optotech</td><td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td><td></td></tr><tr><td>Optical fiber</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>Power meter</td><td>Coherent</td><td>Laser Check</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Axon Instruments</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td><td>LSM 510 meta-confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Utilizzando protocolli 1, 2, e 3 qui descritte, un effetto stimolante sulla differenziazione è stata osservata in NG108-15 cellule neuronali coltivate con NP Au (Au NR, poli (styrenesulfonate) Rivestiti Au NRs e silice rivestite Au NR) dopo laser esposizioni tra 1,25 e 7,5 W · cm -2. Immagini confocale di rhodamineB marcato Au NRs dimostrato che le particelle sono stati internalizzati dal giorno 1 di incubazione 12. La localizzazione è stata osservata prevalentemente nel citoplasma cellulare, indicando che il meccanismo preferito di assorbimento attraverso la membrana era corpo cellulare 12. I principali cambiamenti morfologici rilevati dopo indurre la differenziazione in cellule neuronali NG108-15 erano l&#39;arresto della proliferazione, l&#39;espressione della proteina βIII-tubulina e la conseguenza di neuriti, che sono state analizzate in termini di lunghezza massima e il numero 22. I campioni coltivati ​​con NR hanno mostrato un aumento di lunghezza dei neuriti al laser irradiANCE livelli misurati qui (tra 1,25 e 7,5 W · cm -2). I campioni di controllo (colture cellulari senza NP e irradiati con la stessa potenza del laser) hanno mostrato alcun cambiamento significativo di lunghezza. Utilizzando una dose di irradiazione di 7,5 W · cm -2, la lunghezza dei neuriti finale NG108-15 coltura con Au NR era maggiore di circa 36% (p &lt;0.01) rispetto ai campioni non laser irradiati. Questo comportamento non è stato specificamente legato alla chimica di superficie delle NR. Questi valori erano quasi il 20% maggiore di neuriti sviluppati da NG108 -15 sola ed esposti allo stesso valore di esposizione laser (p &lt;0.05) 12. Questi risultati sono in linea con gli studi precedentemente pubblicati su PC12 cellule neuronali in coltura con nanotubi piezoelettrici e irradiati con radiazioni ultrasuoni 7. Esperimenti di controllo senza Au NRs anche mostrato alcuni effetti stimolatori della luce 780 nm in termini di percentuale di neuroni con neuriti e il numero di NEurites per neurone. Questa stimolazione è stato più efficace a potenze laser inferiori (1,25 W ∙ cm -2) con conseguente riduzione al l&#39;energia laser più alto (7,5 W ∙ cm -2) 12. Una stimolazione moderata causato dalle NP senza irradiazione laser (poly (styrenesulfonate) Rivestiti e silice rivestite solo) è stato rilevato nella percentuale di neuroni con neuriti 12. Questi risultati sono in linea con le osservazioni recentemente pubblicati che le nanoparticelle d&#39;oro possono aumentare l&#39;attività neuronale in vitro 23,24. La figura 2 mostra un esempio di immagini epifluorescenza di cellule neuronali differenziate NG108-15 coltivate da solo (Figura 2a) o con Au NR (Figura 2B ) ed irradiati con differenti potenze laser (indicati in figura). Il potenziale per il rilascio intracellulare photo-generated Ca 2+ è stata valutata utilizzando la luce pulsata NIR secondo protocolli 1, 2, e4. ioni calcio svolgono un ruolo importante in diverse attività cellulari, come la mitosi, la contrazione muscolare e l&#39;estensione dei neuriti 25,26. In risposta ad uno stimolo, Ca 2+ aumenta, oscilla e diminuisce, portando all&#39;attivazione, la modulazione o cessazione di una funzione specifica cella. Recentemente, Ca 2+ transitori sono anche state osservate a seguito di esposizione laser IR in cardiomiociti. In questo lavoro, il Ca 2+ risposte evocate dopo l&#39;esposizione IR esposto ampiezze inferiori e tempi di recupero più veloce del spontanee Ca 2+ transitori 2. La figura 3 mostra un esempio di NG108-15 cellule neuronali caricati con Fluo-04:00 e ripreso con una microscopio confocale. Fluo-4:00 è stato osservato per entrare nella membrana cellulare in maniera non distruttiva, risultante in una distribuzione generalmente uniforme dell&#39;indicatore attraverso il citoplasma della cellula. È stato rilevato solo lievi organello colorazione nucleare o citoplasmatica. Come precedentemente indicato, NR dovevano essere situato intracellulare 12. NG108-15 sole cellule neuronali o coltivate con Au NRs e poli (styrenesulfonate) Rivestiti-Au NRs sono stati esposti in seguito a irradianze laser tra 0,07 J ∙ cm -2 e 370 J ∙ cm -2, con la frequenza laser modulato in gamma di 0,5-2 Hz. La figura 4 mostra esempi rappresentativi di come l&#39;ampiezza delle risposte è stato mappato in funzione del tempo. L&#39;ampiezza del Ca 2+ risposta varia con l&#39;esposizione radiante (Figura 4A - C) e non era osservato essere costantemente attivato da impulsi laser (Figura 4C) 13. Le più probabili spiegazioni erano la deplezione transiente di Ca2 + intracellulare negozi attribuiti al incompleta Ca 2+ carico 2 o la diversa efficienza NR internalizzazione nelle cellule neuronali. Quando NR non sono stati utilizzati in culture (esperimenti di controllo, la figura 4D), è stato anche osservato un effetto stimolante della luce 780 nm. Tuttavia, questo prodotto inferiori picchi di ampiezza fluorescenza e minore probabilità di attivazione (rilevata in solo il 16% dei campioni analizzati). Nel complesso, una probabilità del 48% di attivazione cellulare indotta da laser NR è stato raggiunto e nonostante gli eventi di fondo dovuta alla luce 780 nm, l&#39;esposizione di cellule NR-trattate dimostrato maggiore efficienza stimolazione con minore energia laser e picchi elevati di risposta 13. Infatti, la risposta di calcio è risultato picco a 0,33 J ∙ cm -2 nelle cellule NR-trattate. Questo è stato attribuito all&#39;inibizione termico 13. Durante gli esperimenti, prove di blebbing o qualsiasi altra forma di perturbazione membrana cellulare è stato rilevato, il che è coerente con i risultati di Huang et al. Hanno riportato che fotodistruzione cellulare con una densità di potenza relativamente elevata di 19 W ∙ cm -2 richiesto 4 min 27. Nessuna attività spontanea nelle cellule NR-trattati è stato registrato senza esposizione laser. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /> Figura 1: Fibra ottica sperimentale setup (A) e irradianze laser media in funzione della potenza del laser per un fascio laser di superficie uguale a 0,4 mm 2 (B). Parametri del fascio sono (A): metà-angolo del cono massima di luce uscenti dalla fibra (θ), il raggio del fascio (r) e la distanza tra la fibra ottica e il campione (d). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig2.jpg" /> Figura 2: Esempi di immagini epifluorescenza di cellule neuronali differenziate NG108-15 coltivate da solo (A) o con Au NR (B) e irradiati con diverse potenze laser (indicate in figura). I campioni sono stati incubated per un giorno prima dell&#39;irraggiamento laser. Le cellule sono state fissate e etichettati per anti-β-tubulina III (rosso) e DAPI (blu) tre giorni dopo l&#39;irradiazione laser. Barre di scala sono 100 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig3.jpg" /> Figura 3: Esempio di differenziati NG108-15 cellule neuronali caricate con indicatore Fluo4-AM Ca 2+ L&#39;immagine è stata scattata con un microscopio confocale invertito con un obiettivo ad immersione in olio 40X.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig4.jpg" /> Figura 4: Esempi rappresentativi di indotta laser Ca 2+ variazioni in funzione del tempo in NG108-15 cellule neuronali coltivate in condizioni prive di siero per tre giorni con (A) poli (styrenesulfonate) -au NR, (B, C) Au NR, e (D) senza NR (campione di controllo). Questi risultati sono statiottenuto con impulsi laser di 100 msec (A, C, D) e 50 msec (B). Le frequenze usate per gli esperimenti (linee verticali tratteggiate) erano 1 Hz (A - C) e 0,5 Hz (D). Le esposizioni radianti calcolati erano 69.4 J ∙ cm -2 (A), il 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0.37 J ∙ cm -2 (C) e 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 indica l&#39;aumento massimo di fluorescenza rilevato in NG108 -15 cellule neuronali, dalla calibrazione con ionomicina (riprodotto con il permesso 13).

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Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Video: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Ricerca

Neuroscienze

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

Microelettrodi in fibra di carbonio modificati con nanoparticle d'oro per una migliore rilevazione neurochimica

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Chimica

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Bioingegneria

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

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