Tra le diverse strategie per la produzione di proteine ricombinanti nelle piante, l'espressione VERS a base vegetale decostruita fornisce prestazioni superiori, portando a rese elevate in un lasso di tempo relativamente breve. La replicazione di questa tecnologia per la produzione di un vaccino orale ha un grande potenziale per diventare un'alternativa ai vaccini convenzionali nel prossimo futuro. Le foglie di barbabietola rossa liofilizzate trasformate transitoriamente accumulano una quantità di antigeni fotografici adatti all'induzione della tolleranza orale nella prevenzione del diabete di tipo uno.
Questo protocollo sperimentale potrebbe essere esteso a molte specie commestibili diverse dopo una valutazione caso per caso dell'accumulo di proteine ricombinanti. A manifestare la procedura saranno Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo e Roberta Zampieri. Per iniziare questa procedura, coltivare barbabietole rosse e piante di spinaci in una camera di crescita come delineato nel protocollo di testo.
Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di fertilizzante disponibile in commercio a una concentrazione di un grammo per litro. Per l'agroinfiltrazione, utilizzare spinaci di cinque settimane e piante di barbabietola rossa di sei settimane. Dopo aver costruito i vettori di espressione vegetale, inoculare i tre trasformatori A.tumefaciens in 50 millilitri di mezzo LB contenente rifampicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro e antibiotici specifici del vettore come delineato nel protocollo di testo.
Cresci tremando durante la notte a 28 gradi Celsius. Il giorno dopo, pellet le colture batteriche centrifugando a 4500 volte G per 20 minuti. Rimescolare il pellet in 100 millilitri di tampone di infiltrazione contenente MES millimolare e solfato di magnesio millimolare.
Incubare le sospensioni a temperatura ambiente per tre ore. Mescolare un volume uguale di una sospensione batterica contenente uno dei moduli qui mostrati, con il modulo a cinque numeri primi e il modulo integrase. Usando una siringa senza ago, eserti cinque millilitri della miscela di sospensioni.
Premere la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia della pianta mentre si applica delicatamente contro pressione sull'altro lato della foglia. Infiltrarsi nelle prime tre foglie completamente espanse, a partire dall'apice, per ogni pianta. Etichettare le foglie agroinfiltrate con l'etichetta di carta sul gambo fogliare.
Quindi riportare le piante alla camera di crescita in condizioni standard. Nei giorni da quattro a 14 post-infezione, raccogliere le foglie agroinfiltrate e congelarle in azoto liquido. Conservare questo tessuto vegetale a meno 80 gradi Celsius.
In primo luogo, coltivare separatamente i tre trasformatori A.tumefaciens in 50 millilitri di mezzo LB contenente rifampicina ad una concentrazione di 50 microlitri per millilitro e antibiotici appropriati specifici per vettore tremando durante la notte a 28 gradi Celsius. Il giorno dopo, pellet le colture batteriche centrifugando a 4500 volte G per 20 minuti. Resuspend il pellet in 1 litro di tampone di infiltrazione a un OD600 di 0,35 e incubare le sospensioni a temperatura ambiente per tre ore.
Aggiungere quindi lo 0,01% del detersivo ad ogni sospensione. Mescolare un volume uguale di una sospensione batterica contenente uno dei moduli qui mostrati con il modulo a cinque numeri primi e il modulo integrase. Inserire una pianta di barbabietola rossa vecchia di sei settimane nel supporto.
Invertire il supporto e posizionarlo sopra un becher contenente due litri di un bagno di infiltrazione per immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione. Successivamente, trasferire il bagno di infiltrazione con la pianta sommersa nella camera di infiltrazione e chiuderlo. Accendere la pompa per vuoto e aprire la valvola di aspirazione sottovuoto sulla camera di infiltrazione.
Una volta che la pressione nella camera è scesa a 90 millibar, mantenere il vuoto per tre minuti. Quindi rilasciare il vuoto per 45 secondi. Quando la camera è tornata alla pressione atmosferica, aprire la camera e rimuovere la pianta infiltrata dal bagno batterico.
Riportare la pianta alla camera di crescita. Il giorno della massima espressione, raccogliere le foglie infiltrate e congelarle in azoto liquido come descritto in precedenza. In primo luogo, raccogliere il delta agroinfiltrato sottovuoto 87 GAD65mut esprimendo foglie di barbabietola rossa al picco di espressione e congelarle in azoto liquido.
Liofilizzare le foglie congelate a meno 50 gradi Celsius e a 0,04 millibar per 72 ore. Quindi conservali a meno 80 gradi Celsius. Quando è pronto per procedere, macinare le foglie in una polvere fine e conservare a temperatura ambiente in un contenitore sigillato con gel di silice per escludere l'umidità.
Per la simulazione della digestione gastrica, pesare 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e riprenderle in sei millilitri di PBS. Utilizzare sei acido cloridrico molare per regolare il pH del campione a due. Aggiungere quattro milligrammi per millilitri pepsina dalla mucosa gastrica suina e 10 millimolare acido cloridrico, per ottenere una concentrazione finale di pepsina di un milligrammo per millilitro.
Agitare il campione a 37 gradi Celsius per 120 minuti. Quindi, utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH del campione a otto e inattivare la pepsina. Trasferire 750 aliquote microliter di ciascun campione in tubi di microcentrifugo e centrifugare le aliquote a 20.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Raccogliere ogni supernatante separatamente e rimescolare ogni pellet in un unico volume supernatante di tampone di carico. Quindi analizzare sia il supernatante che il pellet rimescolato mediante analisi western blot. Per l'analisi dell'integrità cellulare, preparare due campioni di 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e rimorsi entrambi in sei millilitri di PBS.
Utilizzare sei acido cloridrico molare per regolare il pH di un campione a due. Agitare entrambi i campioni a 37 gradi Celsius per 120 minuti. Quindi aliquote 750 microlitri di ciascun campione a tubi a microcentrifugo.
Centrifuga a 20.000 volte G e a 4 gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere ogni supernatante separatamente e rimescolare ogni pellet in un unico volume supernatante di tampone di carico. Quindi analizzare sia il supernatante che il pellet rimescolato mediante analisi western blot.
In primo luogo, pesare 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e riprenderle in otto millilitri di PBS sterile. Vortice per un minuto. Piatto un millilitro di ogni omogeneato di foglie liofilizzato in uno dei cinque mezzi LB selettivi preparati.
Incubare le piastre a 28 gradi Celsius per tre giorni. Dopodiché, conta le colonie di agrobatteri coltivate su ogni piatto e calcola la carica batterica residua come il numero di unità di formazione della colonia per millilitro dell'omogeneato di foglie liofilizzato. In questo lavoro, un vaccino orale è sviluppato nel tessuto vegetale commestibile.
Le piante di barbabietola rossa e spinaci vengono manualmente agroinfiltrate con sospensioni di A.tumefaciens che trasportano vettori di espressione ricombinante EGFP, e l'espressione proteica fluorescente è vista dall'analisi western blot e quantificata sotto la luce UV. Il sistema di barbabietole rosse è caratterizzato da una maggiore espressione EGFP, raggiungendo circa 544 microgrammi per grammo di peso fogliare fresco a nove giorni dopo l'infezione, mentre gli spinaci hanno raggiunto solo un livello massimo di circa 113,4 microgrammi per grammo di peso fresco delle foglie su 11 giorni dopo l'infezione. Per questo motivo, la barbabietola rossa viene selezionata come host di espressione per tutti gli esperimenti successivi.
Le piante vengono quindi infiltrate sottovuoto con una sospensione A.tumefaciens. Dopo l'estrazione del TSP dalle foglie di agroinfiltrazione, i campioni vengono analizzati dalla macchia occidentale e la proteina ricombinante viene relativamente quantificata da un'analisi densitometrica. Infine, vengono valutati i parametri per lo sviluppo di un potenziale vaccino orale.
Come si vede qui, la proteina bersaglio è vista come stabile dopo il processo di lyophilization. La digestione gastrica viene simulata aggiungendo la pepsina enzima gastrica suina al materiale liofilizzato, a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro, o a un rapporto da uno a 20, a TSP. Entrambe le condizioni di trattamento digestivo si traducono in degradazione della proteina ricombinante.
L'assenza di un segnale specifico nei campioni di pellet dopo la digestione della pepsina suggerisce che dopo la liofilizzazione, le cellule vegetali hanno perso la loro integrità, e questo ha portato alla degradazione proteica target. La procedura deve essere accuratamente adattata alle specie vegetali per quanto riguarda l'infiltrazione sottovuoto e alla proteina ricombinante bersaglio per quanto riguarda l'analisi del corso del tempo. La procedura di dimostrazione potrebbe essere utilizzata anche per la produzione di biofarmaci destinati alla somministrazione orale, come vaccini e anticorpi.
