Questo protocollo è significativo perché apre le porte a ulteriori indagini nella progettazione di sistemi biologici su scala nanometrica in equilibrio dinamico. Questa tecnica colma parte del divario tra strutture ingegnerizzate e naturali perché consente lo studio di ciò che potremmo chiamare, l'autoguarigione o la sostituzione dinamica dei componenti molecolari. Il consiglio più importante per provare questa tecnica per la prima volta è assicurarsi che lo sperimentatore se ne stia seguendo tutti i protocolli di sicurezza.
In primo luogo, preparare le soluzioni stock come delineato nel protocollo di testo. Pipettare 21,8 microlitri di BRB80 Buffer in un piccolo tubo di microfuga. Aggiungere 1 microliter della soluzione stock di cloruro di magnesio, 1 microliter della soluzione stock GTP e 1,2 microlitri della soluzione stock DMSO per completare la preparazione del buffer di crescita dei microtubuli.
Per iniziare la polimerizzazione dei microtubuli, aggiungere 6,25 microlitri di tampone di crescita dei microtubuli direttamente in un'aliquota di 20 microgrammi di tubulina lofilizzata;etichettata per essere eccitata a 647 nanometri. Vortice a 40 RPS per 5 secondi. Raffreddare l'aliquota sul ghiaccio per 5 minuti.
Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Per iniziare la stabilizzazione dei microtubuli, aggiungere 5 microlitri della soluzione di paclitaxel aliquota a 490 microlitri di tampone BRB80. Vortice la soluzione a 30 RPS per 10 secondi.
Una volta che i 45 minuti di incubazione per i microtubuli sono terminati, aggiungere 5 microlitri di quella soluzione al BRB80 e la miscela paclitaxel, per creare la soluzione MT100. In primo luogo, aggiungere 9,0 microlitri della soluzione aliquota di caseina a 291 microlitri di tampone BRB80. Pipettare 83 microlitri della soluzione di caseina BRB80 in un nuovo tubo di micro centrifuga da 6 millilitri.
Aggiungere 1 microlitro di D-glucosio, glucosio ossidasi, catalasi, DTT, fosfato di creatina e fosfochinasi. Quindi, aggiungere 1 microliter della soluzione ATP stock alla soluzione di motilità. Scorrere, o vortice l'aliquota per distribuire in modo omogeneo le sostanze chimiche.
Quindi, aggiungere 1 microliter di soluzione di chinina preparata alla soluzione di motilità, in modo che la concentrazione finale sia di 20 nanomolari. Aggiungere 10 microlitri della soluzione MT100 alla soluzione di motilità. Per le celle di flusso, utilizzare sia un ampio coverslip che un piccolo coverslip.
Risciacquare tutti i copricapo due volte con etanolo e due volte con acqua ultrapura. Sonicare i copripavimenti lavati in acqua ultrapura per 5 minuti. Quindi, asciugare i copricapo in un forno a una temperatura compresa tra 50 e 75 gradi Celsius.
Utilizzare un detergente UV-ozono per trattare un lato di ogni coverlip per 15 minuti a temperatura ambiente e in normali condizioni atmosferiche. Utilizzando una pinzetta, capovolgere ogni coverslip e utilizzare UV-ozono per trattare anche il lato non trattato. Sonicare i copripasci trattati in acqua ultrapura per 5 minuti.
Quindi, asciugarli in un forno a una temperatura compresa tra 50 e 75 gradi Celsius. Successivamente, indossa equipaggiamento protettivo come delineato nel protocollo di testo. Immergere ogni coverslip in soluzione salina per 15 secondi.
Lavare le coverlips due volte in toluene e tre volte in metanolo. Utilizzare azoto pressurizzato per asciugare i copricapo. Una volta che i copricapo sono asciutti, tagliare un pezzo di nastro a doppia parte che è di 2 centimetri per 2,5 centimetri.
Tagliare questo pezzo a metà verticalmente in due strisce di 1 centimetro per 2,5 centimetri. Metti il grande copripazzo su un delicato tergicristallo e attacca le strisce del nastro ad esso, per quanto riguarda la lunghezza lungo i bordi per creare un'area di 1 centimetro per 2,5 centimetri tra i pezzi di nastro. Attaccare il piccolo coverslip sopra le strisce di nastro per completare l'assemblaggio della cella di flusso.
In primo luogo, scorrono circa 20 microlitri della soluzione PEG-PPG-PEG nella cella di flusso assemblata. Lasciare assorbire la soluzione sulla superficie per 5 minuti, quindi scambiare questa soluzione con 20 microlitri di tampone BRB80 tre volte facendo scorrere il buffer. Flusso 20 microlitri della soluzione di motilità nella cella di flusso.
Successivamente, sigillare i bordi della cella di flusso con grasso per evitare l'evaporazione se l'esperimento pianificato è più lungo di un'ora. Eseguire l'imaging utilizzando una microscopia a florescence interna totale di tipo oggettivo. Metti una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo.
Quindi, posizionare la cella di flusso sulla piattaforma del microscopio. E portare l'obiettivo fino a quando non ci sarà contatto tra l'olio sull'obiettivo e la cella di flusso. Utilizzare il sistema di copertura interblocco del microscopio per impedire la fuoriuscita di tutta la luce laser.
Quindi, accendi il laser e concentrati sulla superficie inferiore della cella di flusso usando un laser da 642 nanometri per immaginire i microtubuli e un laser da 488 nanometri per immaginire i motori della china GFP. Registra le immagini o i video di interesse. Le immagini possono essere registrate per tutto il tempo in cui c'è motilità nella cella di flusso.
In questo studio viene presentato un sistema attivo su scala nanometrica, che si autoassembla blocchi di costruzione debolmente vincolanti per costruire la propria traccia. Utilizzando la microscopia tirf, i microtubuli scorrevoli sono separatamente immagini dai motori a cinesinina. I microtubuli sono visibili all'eccitazione con un laser da 647 nanometri.
E la chiesina GFP è visibile quando eccitata con un laser da 488 nanometri. Il tempo tra l'eccitazione e la luce rossa e verde era inferiore a un secondo. Come si può vedere, i microtubuli scorrevoli accumulano motori di chinina dalla soluzione e li depositano sulla superficie.
I motori a cinesinina rimangono sulla scia dei microtubuli per un breve periodo di tempo prima di tornare in soluzione. È molto importante avere la corretta concentrazione di reagenti nell'antifadio della soluzione di motilità, altrimenti lo sbiancamento fotografico causerebbe il fallimento dell'esperimento. Questa tecnica apre la strada a un uso più efficiente dei motori proteici nei sistemi di ingegneria su scala nanometrica.
Quindi, consentendo la progettazione e lo studio di nanostrutture più complesse.
