Questo protocollo colma una lacuna tecnica nella nostra capacità di generare array di sequenze ultra-lunghe. Ci permette di esaminare la complessità del genoma che è limitata dagli attuali approcci a lettura breve nella genomica. Il metodo è unico in termini di prestazioni, robustezza, versatilità e potenziale di integrazione con nuove applicazioni promettenti.
È applicabile a diversi materiali e può essere modulato per diverse dimensioni istantanee. Questa tecnica ha iniziato a rivoluzionare il panorama clinico. La sua utilità di diagnosi nei disturbi di espansione ripetuta ha superato molte carenze attuali.
Alcuni registri dei trapianti hanno utilizzato la tipizzazione HLA ad alta risoluzione per un migliore risultato clinico. Questi metodi forniscono informazioni a lungo raggio precedentemente inaccessibili come la varianza strutturale graduale e complessa. Insieme alla lettura epigenetica in un unico test, consentirà la medicina di precisione.
È un lungo protocollo con molte nuove tecniche ed è difficile sapere se funziona fino al sequenziamento finale. Consiglio di praticare il caricamento su vecchie celle di flusso prima di eseguire campioni. I collaboratori hanno affermato che alcune tecniche sono confuse rispetto agli approcci di lettura breve.
In particolare, l'estrazione è più delicata grazie al DNA di alta qualità e ad alto peso molecolare. Per iniziare l'estrazione del DNA HMW, aggiungere prima 200 microlitri della sospensione cellulare a 10 millilitri di tampone di lysis in un tubo da 50 millilitri. Quindi, vortice alla massima velocità per tre secondi.
E incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, aggiungere due microlitri di RNS-A al lisato. Ruotare delicatamente il tubo da 50 millilitri per mescolare il campione e incubare a 37 gradi celsius per un'ora.
Dopo l'incubazione, aggiungere al lisato 10 millilitri dello strato fenolo della miscela fenolo-cloroformio-isoamil alcolico. E mettere il tubo su un rotatore a 20 giri/min per 10 minuti sotto una cappa aspirante. Dopo la centrifugazione con tubi di gel, versare con cura il supernatante in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Quindi, aggiungere 25 millilitri di etanolo ghiacciato al 100% e ruotare delicatamente il tubo a mano, fino a quando il DNA precipita. Piegare una punta da 20 microliter per fare un gancio. Usando il gancio, estraere con cura il DNA HMW e lasciare cadere il liquido.
Quindi, posizionare il DNA in un tubo da 50 millilitri contenente 40 millilitri di etanolo al 70% e invertire delicatamente il tubo tre volte per lavare il DNA. Per preparare la libreria meccanica a base di cesoiatura, utilizzare prima una siringa priva di aghi da 100 millilitri per aspirare a tutto il DNA. Quindi, mettere un ago calibro 27 sulla siringa ed espellere tutto il DNA nel piatto delicatamente e lentamente.
Ripeti 29 volte. Successivamente, aggiungere 143 microlitri delle perline magnetiche ri-sospese e 143 microlitri della miscela di reazione di riparazione del DNA a un tubo. Far scorrere il tubo sei volte per mescolare delicatamente e mettere il tubo su un rotatore a 20 giri/min per 30 minuti.
Centrifugare il tubo a 1000G per due secondi a temperatura ambiente per far girare il campione, quindi posizionare il tubo su un rack magnetico per 10 minuti. Quindi, scartare il supernatante mentre il tubo è ancora sul rack. Aggiungere 400 microlitri di etanolo appena preparato al 70%.
Aspetta 30 secondi. E poi rimuovere l'etanolo. Quindi, centrifugare il tubo a 1000G per due secondi a temperatura ambiente per far girare il campione.
Riposizionare il tubo sul rack magnetico e rimuovere l'etanolo residuo. Asciugare all'aria il pellet per 30 secondi. Quindi, rimuovere il tubo dal rack magnetico e aggiungere 103 microlitri di tampone T-E.
Quindi, scorrere delicatamente il tubo per assicurarsi che le perline siano coperte nel tampone e mettere il tubo sul rotatore a temperatura ambiente per 30 minuti. Infine, riposizionare il tubo sul rack magnetico per 10 minuti per pellettare le perline. Utilizzare una punta di foro larga P200 per trasferire 100 microlitri dell'eluito in un tubo da 0,2 millilitri e procedere alla riparazione finale delle reazioni di coda dA e legatura dell'adattatore.
Per preparare la libreria basata sulla frammentazione della trasposasi, prima fai una reazione di tagmentazione del DNA aggiungendo 22 microlitri del DNA HMW, un microlitro di Triss millimolare, pH 8, con 0,02%Triton X-100 e 1 microlitro del mix di frammentazione, a un tubo da 0,2 millilitri. Successivamente, utilizzare una punta di foro larga P200 per mescolare la reazione sei volte e incubare a 30 gradi celsius per un minuto, seguita da 80 gradi celsius per un minuto. Tenere a quattro gradi Celsius.
Infine, utilizzare una punta di foro larga P200 per trasferire la reazione a un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere rapidamente 1 microlitro di miscela di adattatori rapidi. Utilizzare una punta di foro larga P200 per mescolare la reazione sei volte. Incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora e procedere al sequenziamento.
Per iniziare il sequenziamento, inserire prima una nuova cella di flusso in uno dei canali del dispositivo Nanopore. Quindi, sul software di controllo del sequenziamento di accompagnamento, selezionare la casella di posizione della cella di flusso. Selezionare il tipo di cella di flusso corretto e fare clic sul flusso di lavoro della cella di flusso di controllo.
Fare clic sul pulsante di test iniziale per avviare l'analisi QC della cella di flusso. Successivamente, con una pipetta P1000 impostata su 100 microlitri, disegnare meno di 30 microlitri di buffer per rimuovere le bolle dalla cella di flusso. Aggiungere 30 microlitri del mix di adescamento per coprire la parte superiore della porta di adescamento per evitare l'introduzione di bolle.
Quindi, pipetta 800 microlitri della miscela di adescamento nella porta di adescamento per caricare la cella di flusso. Eseni la punta quando ci sono circa 50 microlitri del mix di adescamento a sinistra e aggiungi il resto del mix di adescamento sulla parte superiore della porta di adescamento. Successivamente, con una pipetta P1000, aggiungere 200 microlitri della miscela di adescamento nella cella di flusso.
Quindi, poco prima del caricamento, utilizzare una pipetta P200 impostata su 80 microlitri per pipettare su e giù per la libreria del DNA sei volte. Infine, caricare la combinazione di libreria per quanto riguarda il rilascio nella cella di flusso attraverso la porta di esempio e procedere al sequenziamento e all'analisi dei dati. L'analisi QC del DNA pronto per la costruzione di biblioteche meccaniche basate sulla tranciatura ha portato al rapporto di purezza da 260 a 280 di circa 1,9 e al rapporto da 260 a 230 di circa 2,3, mostrando un buon campione di DNA.
Lo stesso risultato è stato visto usando la costruzione di una libreria basata sulla frammentazione pronta per la trasposasi del DNA. Il controllo della qualità delle dimensioni del DNA HMW tranciato ad ago mediante elettroforesi del gel di campo d'impulso ha mostrato che la maggior parte del DNA HMW era più grande di 50 kilobase. I risultati di quattro esecuzioni che utilizzano la cella HG00733 hanno mostrato che l'N50 di una libreria meccanica basata sulla tranciatura era più corto di una libreria basata sulla frammentazione trasposta.
Inoltre, tutte e quattro le corse avevano oltre 2300 letture con lunghezza superiore a 100 kilobase. La lunghezza massima era più lunga nelle librerie basate sulla frammentazione della trasposasi con il suo tempo di preparazione più breve, rispetto alle librerie meccaniche basate sulla tranciatura. Le librerie meccaniche basate sulla cesoia producevano più letture totali rispetto alle librerie basate sulla frammentazione trasposasi, indicando una resa più elevata.
Entrambe le biblioteche hanno mostrato un'alta qualità costante e oltre il 97% delle loro basi totali erano allineate con il genoma di riferimento umano. Le distribuzioni di dimensioni previste hanno mostrato che tutte e quattro le esecuzioni avevano una grande percentuale di dati superiori a 50 kilobase, mentre le librerie basate sulla frammentazione trasposasi avevano un rapporto più elevato di letture ultra lunghe. L'obiettivo generale è quello di mantenere intatto il DNA, quindi è importante evitare qualsiasi dura manipolazione del DNA.
Un fattore chiave che può massimizzare il valore del metodo è l'analisi computazionale. Il nostro team ha sviluppato una pipeline di analisi a lettura lunga chiamata PICKY in grado di rilevare una gamma completa di SUV ad alta sensibilità. Aprirà nuove strade ad aree entusiasmanti come il rilevamento di SUV complessi e riarrangiamenti e modifiche graduali a livello di singola molecola.
Ciò migliorerà notevolmente la nostra comprensione dell'architettura del genoma. Il fenolo è molto corrosivo. È necessario lavorare con esso in un cappuccio per fumi con dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, occhiali di sicurezza, un camice da laboratorio, pantaloni lunghi e scarpe.
