Questo protocollo è significativo, in quanto il PIVEC consente l'esposizione diretta di una coltura cellulare agli aerosol del mondo reale. Il sistema può essere avvisato di campionare la stessa aria respirata da una persona, consentendo un nuovo tipo di monitoraggio della qualità dell'aria. Il vantaggio principale di questa tecnica è la facilità di catturare aerosol su cellule polmonari coltivate in luoghi inaccessibili ai sistemi da banco, come alla fonte di ammissione o all'interno della zona di respirazione.
A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Lynn Secondo, una neolaureata del mio laboratorio, e Nathaniel Wygal, uno studente universitario del mio laboratorio. Per questo esperimento, materiali di prova immagazzinati e ambiente controllato per 24 ore prima del test. Per assemblare il sistema di dispersione a secco, collegare la valvola a sfera a un'estremità del tubo filettato lungo 1/8 pollice.
Questo serve come tramoggia di particelle. Attraverso l'estremità aperta della tramoggia delle particelle, mettere la quantità desiderata di nanoparticelle di rame. Quindi chiudere la tramoggia delle particelle con un'altra valvola a sfera.
Collegare il tubo lungo due pollici e di dimensioni 1/8 alla valvola. Posizionare un tubo di diametro esterno lungo tre pollici e 1/2 pollice attorno al tubo da due pollici. Inserire un filtro HEPA all'interno del tubo corto, assicurandosi che la direzione del flusso sia attraverso la valvola a sfera.
Utilizzando la filettatura, collegare il generatore di vuoto all'altra valvola a sfera. Quindi, collegare il generatore di vuoto al serbatoio dell'aria. Mettere tubi di diametro esterno da 1/4 di pollice sopra l'uscita del generatore di vuoto per collegarlo alla configurazione sperimentale.
Ruotare la valvola principale e le valvole di regolazione sul serbatoio dell'aria per impostare il flusso desiderato. Aprire la valvola a sfera, più vicina al filtro HEPA, quindi aprire la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto. Tienili aperti durante la caratterizzazione o l'esposizione prima di chiuderli.
Prima la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto e poi la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA. Chiudere le valvole principali e regolatorie sul serbatoio dell'aria per interrompere il flusso. Per pulire, utilizzare il 70% di etanolo per lavare le valvole a sfera e il generatore di vuoto.
Mettere tubi metallici in autoclave per la sterilizzazione. Dopo aver coltivato le cellule all'interfaccia del liquido dell'aria, lasciare che le cellule equilibrano per 24 ore. Per assemblare, prendere la base PIVEC con il pozzo rivolto verso l'alto e collegare l'adattatore di inserimento delle impostazioni cultura delle celle nella parte superiore.
Aggiungere quattro millilitri di mezzi di coltura cellulare al pozzo della base del PIVEC utilizzando una micropipetta. Utilizzare le pinzette per posizionare l'inserto delle impostazioni cultura delle celle all'interno dell'adattatore. Con la parte stretta del pezzo superiore PIVEC rivolto verso l'alto, connettersi all'adattatore.
Con attenzione, avvolgere PIVEC con un unico strato di nastro adesivo. Spingere per collegare pezzi di cassetta da 37 millimetri nella parte superiore e inferiore del PIVEC. Posizionare adattatori spinati da 1/4 di pollice nell'ingresso e nell'uscita della cassetta.
Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno a PIVEC con i fili alla base. Nastro da fissare. Avvolgere PIVEC con otto colpi di foglio di alluminio per l'isolamento e fissare con nastro adesivo.
Collegare tubi di diametro esterno da 1/2 pollice all'adattatore nella parte superiore del PIVEC. Rimuovere i tubi porosi dall'acqua sterile e posizionarsi all'interno dei tubi sopra PIVEC. Sistema di trasferimento sul cofano dei fumi e bloccare il PIVEC sul supporto dell'anello e fissare.
Collegare PIVEC al sistema aerosol collegando i tubi da 1/4 di diametro all'uscita del generatore di aerosol ai tubi porosi. Collegare l'uscita del PIVEC a tubi da 1/4 di diametro collegati a un filtro HEPA e a una pompa per vuoto tramite un connettore Y. Accendere le valvole e impostare la portata della pompa su 0,5 litri al minuto.
Esporre le cellule alle nanoparticelle di rame per dieci minuti prima di chiudere le valvole e spegnere la pompa. Rimuovere PIVEC dal sistema aerosol. Estraere l'inserto di coltura cellulare utilizzando una pinzetta e posizionarlo nella piastra sterile del pozzo per iniziare i saggi biologici desiderati.
Punti di esposizione proposti, rimettere l'inserto nell'incubatore di anidride carbonica. Aspirare i supporti da PIVEC utilizzando un contagocce. Utilizzare il 70% di etanolo per lavare il PIVEC e sterilizzarlo con luce ultravioletta per almeno 30 minuti prima dell'esperimento successivo.
Il PIVEC è stato caratterizzato usando tre dimensioni di nanoparticelle di rame per determinare l'efficienza della deposizione. Una maggiore deposizione si osserva complessivamente per il design dei 24 pozzi, quindi il design dei sei pozzi. Diminuisce leggermente per 100 nanometri rispetto alle particelle di rame da 40 nanometri e 800 nanometri.
La concentrazione del numero di particelle degli aerosol di nanoparticelle di rame è stata determinata dal sizer di particelle di mobilità a scansione a base di filtro, così come dalle misurazioni del sizer di particelle ottiche. L'analisi post-esposizione può essere accelerata determinando la relazione di dose tra il filtro da 37 millimetri e l'inserto di coltura cellulare. Il confronto mostra una forte correlazione per particelle di rame di 800 nanometri con un valore p inferiore a 0,05.
Rispetto ai sistemi di esposizione in vitro a flusso perpendicolare in tutta la letteratura, l'efficienza di deposizione del PIVEC nell'intervallo delle dimensioni delle particelle testate è paragonabile o aumentata rispetto ai valori riportati. La cosa più importante da ricordare è che sebbene questo protocollo dimostri l'uso del PIVEC in un ambiente di laboratorio, è stato progettato per misurare le risposte cellulari agli aerosol nel sito di esposizione. Quando si eseguono test in loco, è importante caratterizzare l'efficienza di deposizione dell'aerosol di prova.
L'efficienza di deposizione determina la dose depositata di particelle a cui sono esposte le cellule. Ulteriori test biologici possono essere eseguiti per indagare più endpoint di risposta cellulare a causa dell'esposizione. Il PIVEC è stato utilizzato per valutare la risposta cellulare dovuta agli aerosol generati durante i processi di stampa 3D, come il getto del legante metallico e la fabbricazione di filamenti fusi.
L'uso di nanoparticelle, in particolare in forma di aerosol, può essere pericoloso e qualsiasi esposizione deve essere eseguita in una cappa aspirante. Il lavoro cellulare dovrebbe essere fatto in un armadietto di bio-sicurezza.
