Questo video dimostrerà un metodo semplice per indagare più geni candidati in AML in parallelo, utilizzando il sistema Crisper-Cas9 combinato con il test di crescita competitiva basato sulla citometria del flusso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida e scalabile. A dimostrare la procedura sarà Bo Rui Chen, un post doc del nostro laboratorio.
Un software di progettazione CRISPR basato sul web viene utilizzato per progettare da quattro a sei RNA a guida singola per il gene di interesse. Per iniziare, compilare le informazioni appropriate nei campi con asterischi. Quindi selezionare il genoma di destinazione per la progettazione di RNA a guida singola.
Incollare la sequenza di destinazione nella casella di sequenza e fare clic sul pulsante invia. Per la clonazione nel plasmide di espressione dell'RNA a guida singola desiderato, anteponere i nucleotidi CACC al senso di oglionucleotide e AAAC all'oligonucleotide antisenso gratuito inverso. Il senso premiscelato e gli oligonucleotidi antisenso vengono quindi ordinati da un'azienda in una piastra da 96 po po ', etichettata Oligo Mix.
Impostare una piastra di pozzo U-Bottom 96 separata, etichettata piastra di ricottura. Preparare un mix master di un microlitro di polinucleotide chinasi T4, un microlitro di tampone di legatura del DNA T4 10x e sei microlitri di acqua per reazione di ricottura. Aggiungere 8 microlitri del master mix ad ogni pozzo della piastra di ricottura, seguiti da 2 microlitri di senso premiscelato e oligonucleotidi antisenso.
Pipetta da due a tre volte delicatamente per mescolare bene, quindi ruotare brevemente la piastra per ottenere le miscele sul fondo dei pozzi. Utilizzare il seguente programma di ricottura in un computer PCR. 37 gradi Celsius per 30 minuti, 95 gradi Celsius per due minuti e 30 secondi, seguiti da raffreddamento lento a 22 gradi Celsius a una velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo.
Al termine della ricottura, preparare una piastra fresca da 96 porvili, etichettata Diluted Oligo Mix, diluendo gli oligonucleotidi fosforilati e ricotti dalla reazione di ricottura uno a 200 con acqua. Linearizzare il vettore di espressione dell'RNA a guida singola digerendo cinque microgrammi del vettore con 1,5 microlitri di enzima di restrizione BBS1, utilizzando un buffer appropriato a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, prendi una piastra di legatura con etichetta 96 ben placcata e aggiungi 20 nanogrammi del vettore di espressione dell'RNA a guida singola digerito BBS1 a una legatura di RNA a guida singola ben per desiderata.
A questo, aggiungere 2 microlitri di oligonucleotidi ricotti fosforilati dalla piastra diluita Oligo Mix. Aggiungere ad ogni pozzo, un microlitro di tampone di ligasi T4 10X e un microlitro di enzima T4 ligasi e pipetta delicatamente da mescolare. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore.
Circa 10 minuti prima che la reazione di legatura sia fatta, riempire 90 microlitri di cellule E.coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Trasferire 10 aliquote microliter delle cellule competenti in ogni pozzo di una piastra separata di 96 pozzetti singolarmente. Aggiungere la miscela di legatura nei pozzi contenenti le cellule competenti.
Pipettare su e giù delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Pipettare cinque microlitri del dna batterico si mescolano da ogni reazione di trasformazione direttamente in un pozzo di una piastra di 6 pozzetti, contenente agar LB con 100 milligrammi per millilitro di ampicillina. Aggiungere da cinque a otto perline di vetro a ciascun pozzo e agitare la piastra da 6 pozzale da otto a 10 volte con un movimento circolare.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, scegli una o due singole colonie da ogni pozzo, con una punta sterile di pipetta da 20 microliter, e strisciala su un punto etichettato su una piastra di petri sterile di 10 centimetri, con agar LB e 100 milligrammi per millilitro di ampicillina Dopo aver strisciato sulla piastra LB, espellere la punta in tre millilitri di mezzo di ampicillina in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri , contrassegnato con il corrispondente numero di clone batterico. La piastra batterica viene quindi inviata direttamente per il sequenziamento sanger.
Dopo una conferma di sequenza degli RNA a guida singola clonati, purificare il DNA dal corrispondente tubo da 14 millilitri, utilizzando un kit miniprep secondo le istruzioni del produttore. Le particelle lentivirali a RNA a guida singola sono prodotte in un formato a 96 punti, come descritto nel protocollo di testo. E il supernatante virale è immediatamente congelato a meno 80 gradi Celsius.
Un giorno prima della trasduzione di RNA a guida singola nelle cellule AML Cas9, rivestire una piastra piana di coltura non tissutale trattata con 96 pozzetti, con 100 millilitri di frammento di fibronectina umana ricombinante ad una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Avvolgere la piastra con un involucro di aggrappamento per evitare la perdita di evaporazione e lasciarla in panchina durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il frammento di fibronecina umana ricombinante da ogni pozzo della piastra del pozzo 96.
Scongelare il supernatante virale di ogni singolo RNA guida a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri di supernatante virale da ogni tubo a ciascun pozzo rivestito della piastra di trasduzione. Avvolgere la piastra con un involucro di aggrappamento per evitare potenziali contaminazioni durante la centrifugazione.
Ruotare la piastra a 1.300 volte g a 35 gradi Celsius per 90 minuti. Verso la fine della spinfezione, contare l'alto Cas9 che esprime le cellule B3 clone dal pallone di coltura. Dopo il conteggio, spingi verso il basso il numero richiesto di cellule e ripreposi in mezzo fresco.
Dopo la spinfection di 90 minuti, utilizzare una pipetta multicanale regolata a 50 microlitri per rimuovere lentamente il supernatante da tutti i pozzi inclinando la piastra. Aggiungere 100 microliter della coltura di cellule B3 clonate a ciascuna ben lentamente, scivolando giù dal bordo. Ruotare la piastra a 1.300 volte g a 35 gradi Celsius per due minuti per lasciare che le cellule si sistemino verso il basso.
Trasferire la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere 100 microlitri di mezzo fresco a ogni bene contenente singole cellule trasdutte di RNA guida, in modo che il volume medio finale sia di 200 microlitri. Riportare la piastra all'incubatore.
72 ore dopo la trasduzione, controllare la percentuale di SINGOLO RNA guida contenente cellule positive BFP in ogni pozzo per citometria del flusso. Utilizzare un colorante di vitalità cellulare per contrassegnare ed escludere le cellule morte dall'analisi. Continuare a ri-placcare una parte delle cellule in nuovi pozzi con mezzo fresco dopo ogni analisi dei fatti per evitare la crescita troppo durante il saggio.
Ogni due o tre giorni, ripetere l'analisi dei fatti per verificare la proporzione relativa di cellule positive del BFP rispetto alle controparti negative della BFP. Analizzare la percentuale di celle positive BFP per ogni punto di tempo, utilizzando un software di analisi dei fatti. La chiave del successo del saggio di proliferazione competitiva è utilizzare le tecniche di gating appropriate per garantire che gli eventuali numeri di cellule vive siano accurati.
Trascinare i file FCS per ogni campione nel software. Fare doppio clic su un file di esempio e tracciare un grafico a punti di dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale, con dispersione in avanti sull'asse x e dispersione laterale sull'asse y. Cancello tutte le cellule.
Fare doppio clic sulle celle gated e tracciare la macchia di vitalità sull'asse y rispetto all'altezza di dispersione in avanti o al grafico a punti dell'area. Cancello la vitalità macchiare le cellule negative. Fare doppio clic sulle celle vive gated e tracciare la BFP sull'asse y rispetto alla dispersione in avanti sull'asse x.
Gate le cellule positive del BFP. Applicare tutti questi gate a tutti i campioni trascinando l'esempio selezionato su tutti gli esempi sotto la scheda gruppo. Fare clic sull'editor di tabelle per creare una tabella di analisi di tutti gli esempi.
Trascinare il conteggio positivo BFP da un campione alla tabella e fare clic sul pulsante di visualizzazione nell'editor di tabelle per creare un report batch di tutti gli esempi, con la tabella che visualizza la percentuale di celle positive BFP. Salvare la tabella come file di Excel. Questo sistema è stato utilizzato per studiare il ruolo dei geni che possono svolgere un ruolo nella proliferazione o sopravvivenza delle linee cellulari AML umane e murine.
Prendendo di mira il locus safe-harbor AAVS1 con due RRNA a guida singola separati non ha avuto alcun effetto sulla proliferazione delle cellule umane MOM13 Cas9 Al contrario, quando è stato preso di mira il gene associato alla replicazione del DNA, RPA3, è stato osservato un calo progressivo e significativo della percentuale di cellule positive BFP rispetto alle controparti non tradotte negative della BFP. Allo stesso modo, gli effetti delle RNA a guida singola rivolte a Dot1l, un regolatore epigenetico, e rodopsina, il gene della pigmentazione oculare, sono stati testati nelle cellule del topo MLL-AF9 Cas9. Gli RNA a guida singola destinati a Dot1l, hanno mostrato un drastico e progressivo declino della proliferazione competitiva in contrasto con gli RNA a guida singola che prendono di mira il rodopsina.
Questi risultati dimostrano la vulnerabilità dell'MLL-AF9 che esprime cellule di leucemia di massa all'esaurimento di Dot1l, confermando risultati pubblicati in precedenza. Supponendo da quattro a sei RNA guida per gene, questo metodo è adatto per essere utilizzato per testare almeno 16-24 geni in parallelo, e può anche essere applicato per testare le dipendenze geniche in qualsiasi linea cellulare tumorale. Nel caso di un maggior numero di geni, come un intero percorso molecolare che deve essere testato nelle cellule AML, gli schermi basati sulla piscina CRISPR-Cas9 saranno più utili.
