Questo metodo ha il potenziale per migliorare la differenziazione delle cellule staminali neurali in vitro e per contribuire al trattamento di malattie neurologiche come il morbo di Parkinson. I principali vantaggi di questa tecnica è che i plasmi atmosferici freddi possono essere applicati in un unico passaggio per la differenziazione sicura diretta delle cellule staminali neurali per il trapianto di tessuti. Il plasma atmosferico freddo può migliorare la differenziazione delle cellule staminali neurali in un breve periodo di trattamento.
E con bisogno di più danni alle cellule, fornendo le cellule desiderate per il trapianto. Inizia seminando circa cinque per dieci alla quinta cellule staminali neurali murine in un pallone quadrato di 25 centimetri. Contenente cinque millilitri di DMEM completo per due o tre giorni a 37 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica.
Quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza, lavare la coltura con un millilitro di PBS. Prima del trattamento, con un millilitro del 25% di tripside per un minuto. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con un millilitro di mezzo di coltura.
E pipetta più volte per generare una singola sospensione cellulare. Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di due volte dieci-quarta per millilitro. Seminare un millilitro di cellule staminali su un coperchio rivestito in poli-D-lsina scivolare per pozzo in nove pozzi di una piastra di coltura a 12 cellule.
Controllare la densità cellulare al microscopio. E riportare le cellule nell'incubatrice per 12 ore. Quando le cellule si sono attaccate, lavare il coperchio scivola due volte con un millilitro di PBS per lavaggio e trattare le cellule con mezzo di differenziazione per 48 ore.
Per l'acquisizione del getto, collegare prima il filo di uscita dell'alimentatore al dispositivo a getto di plasma. E la punta della sonda ad alta tensione con il filo di uscita per rilevare la tensione. Quindi collegare l'altra estremità della sonda ad alta tensione all'oscilloscopio per registrare le informazioni dalla tensione di uscita.
Controllare l'intero circuito per assicurarsi che l'alimentazione, l'oscilloscopio e la sonda ad alta tensione siano tutti a terra. E controllare la linea del gas per assicurarsi che il tubo del gas sia collegato al dispositivo a getto di plasma. Successivamente, aprire le valvole dell'elio e del gas ossigeno e impostare il flusso di gas su un rapporto da un litro a 01 litri al minuto di elio e ossigeno.
Controllare di nuovo il circuito e premere il pulsante di uscita per creare un getto di plasma. Per trattare al plasma le cellule staminali neurali, impostare la distanza tra l'ugello della siringa e il primo pozzo delle cellule a 15 millimetri. Sostituire i supernatanti nelle colture di cellule staminali neurali con 800 microlitri di mezzo di differenziazione fresco.
E posizionare la piastra sotto i getti di plasma. Assicurarsi che l'ugello della siringa sia fissato sopra il centro di ogni pozzo. Creare tre pozzi con plasma per 60 secondi per trattamento e tre pozzi con l'uno per cento di elio e gas ossigeno per 60 secondi per trattamento.
Lasciando tre pozzi non trattati, come controlli. Quindi sostituire i supernatanti con un millilitro di mezzo di differenziazione fresco. E riportare le cellule nell'incubatrice per sei giorni.
Controllare quotidianamente lo stato di differenziazione dei diversi gruppi, sotto un microscopio a contrasto di fase invertito. Dopo il trattamento, lasciare che le cellule equilibrano completamente nel mezzo di condizione per circa un'ora prima di sostituire il supernatante con un nuovo mezzo di differenziazione. Per l'analisi dell'immunofluorescenza, fissare le colture con 500 microlitri del quattro per cento di paraformaldeide per pozzo per 20 minuti a temperatura ambiente.
Seguito da tre delicati risciacqui di cinque minuti, con un millilitro di PBS per lavaggio. Successivamente, permeabilizzare i campioni fissi con tritone X-100 al 2% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Seguito da un risciacquo delicato come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, bloccare qualsiasi legame non specifico con un millilitro di siero di capra al 10% in PBS per campione per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, etichettare le cellule in ogni pozzo con 300 microlitri dell'anticorpo primario di interesse durante la notte a quattro gradi celsius. Seguito da tre lavaggi in PBS come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule con 300 microlitri degli anticorpi secondari appropriati. Incubare per due ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Quindi sciacquare delicatamente le cellule con un millilitro di PBS per pozzo per dieci minuti a temperatura ambiente.
Immagini le cellule su un microscopio a fluorescenza dotato dei filtri appropriati. Le cellule staminali neurali trattate al plasma mostrano un tasso di differenziazione accelerato e un rapporto di differenziazione più elevato rispetto al controllo non trattato e alle cellule staminali trattate con flusso di gas. Dopo il trattamento al plasma, Nestin diminuisce.
Beta-Tubulina III aumenta significativamente. E O4 aumenta leggermente, rispetto alle cellule staminali trattate con controllo e trattate con flusso di gas. Inoltre, dopo 60 secondi di trattamento al plasma, si osserva una robusta espressione di neurone maturo, neurone colinergico e marcatori di motoneuroni.
Con pochissimi neuroni GABAergici e sierotonergici, e nessun neurone dopaminergico rilevato. Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordare, trattare le cellule con un corretto dosaggio plasmatico, perché un lungo e intenso periodo di trattamento del plasma indurrà apoptosi cellulare o necrosi. Ricordarsi di pre-testare anche la vitalità della cella prima dell'applicazione downstream.
